System hodowli proksymalnej: technika hodowli in vitro do badania sygnalizacji parakrynnej między komórkami

W sygnalizacji parakrynnej komórki wytwarzają i wydzielają cząsteczki sygnałowe, które indukują odpowiedzi w sąsiednich komórkach. Aby naśladować sygnalizację parakrynną, zacznij od przygotowania jednokomórkowych zawiesin komórek raka jajnika i komórek międzybłonka w odpowiednim pożywce.

Następnie weź odwróconą porowatą błoniastą wkładkę w sterylnym naczyniu hodowlanym. Odpipetuj zawiesinę komórek rakowych na dolną powierzchnię membrany wkładki, aby utworzyć płynną kopułę. Inkubować, aby komórki mogły się uspokoić i przyczepić do błony.

Odwróć wkładkę, aby spuścić media. Przenieś wkładkę do świeżego naczynia hodowlanego zawierającego pożywkę wzrostową, aby odżywić komórki rakowe przyklejone do dolnej powierzchni błony. Teraz dobrze dodaj zawiesinę komórek międzybłonka do wkładki. Inkubuj, aby komórki przylegały do przeciwnej strony błony, uniemożliwiając jakikolwiek bezpośredni kontakt między dwoma typami komórek.

Podczas hodowli oba typy komórek wydzielają czynniki sygnalizacyjne. Cząsteczki te dyfundują przez porowatą błonę w kierunku sąsiednich komórek. Wiążą się ze specyficznymi receptorami komórkowymi i indukują złożone kaskady sygnałowe w obu typach komórek.

Zacznij od odłączenia komórek raka jajnika od 80% zlewającej się mieszaniny z 1 mililitrem 0,25% trypsyny przez 40 do 60 sekund, a następnie zneutralizuj reakcję za pomocą 6 mililitrów kompletnej pożywki wzrostowej. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 5 mililitrach świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej.

Po zliczeniu rozcieńczyć komórki do 100 000 komórek raka jajnika na mililitr całkowitego stężenia pożywki wzrostowej i umieścić trzy odwrócone 0,4 mikrometra wkładki do hodowli tkankowej z poliwęglanowej membrany membranowej poddane działaniu warunków eksperymentalnych w sterylnym naczyniu do hodowli tkankowej o odpowiedniej wielkości. Oznacz wkładki zgodnie z warunkami eksperymentalnymi i ostrożnie odpipetuj komórki rakowe na dno każdej wkładki w koncentrycznych okręgach, zaczynając od środka membrany i przesuwając się na zewnątrz, aby utworzyć kopułę o pojemności 800 mikrolitrów.

Należy zachować szczególną ostrożność podczas wysiewania komórek na dolną powierzchnię wkładki, aby kopuła komórek zawierających podłoże nie spływała z krawędzi wkładki podczas inkubacji.

Gdy wszystkie wkładki zostaną wysiane, przykryj naczynie i ostrożnie umieść wkładki w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po około 4 godzinach odłącz HPMC z 2 mililitrami 0,25% trypsyny na jedną do dwóch minut, a następnie zneutralizuj reakcję 12 mililitrami kompletnej pożywki wzrostowej.

Zebrać HPMC przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach kompletnej pożywki wzrostowej do liczenia. Rozcieńczyć komórki do 300 000 HPMC na mililitr kompletnej pożywki wzrostowej i dodać 2,5 mililitra świeżej kompletnej pożywki wzrostowej do każdego dołka 6-dołkowej płytki hodowlanej.

Za pomocą sterylnych kleszczy umieść każdą wkładkę prawą stroną do góry w każdym dołku 6-dołkowej płytki, tak aby dolne powierzchnie przyłączone do komórek raka jajnika były zanurzone w pożywce. Następnie wysiewaj 1,5 mililitra HPMC do dołka każdej wkładki i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 72 godziny.

• Paracrine Signaling - Cellular communication through secreted molecules affecting neighboring cells.
• Mesothelial Surface - The membrane where the mesothelial cells adhere and function.
• Culture System - Set-up where cells are grown under controlled conditions, often in vitro.
• Corning 10-013-CV - Specific type of culture dish used for cell adhesion and growth experiments.
• In Vitro Cell Culture Techniques - Methods used to cultivate cells in controlled environments outside of the living organism.

• Introduce Paracrine Signaling – Paracrine signaling is the process by which cells communicate and influence the behavior of neighboring cells via secreted molecules (e.g., paracrine).
• Key Concepts - We can simulate this biological process in an in vitro cell culture system using human mesothelial cells and cancer cells (e.g., culture system).
• Underlying Mechanisms - Both cell types secret signaling factors which bind to receptors and trigger complex responses (e.g., mesothelial surface).
• Connect to Experiment - To study this, cells are cultivated on either side of a porous membrane in a culture dish (e.g., corning 10-013-CV).

• What is paracrine signaling and how does it work in an in vitro culture system?
• How are mesothelial and cancer cells cultured for this study?
• What are the key concepts and mechanisms underlying paracrine signaling?

• Practical Applications - Understanding paracrine signaling could improve diagnosis and treatment of diseases like cancer (e.g., in vitro cell culture techniques).
• Industry Impact - The knowledge acquired is beneficial for the medical and pharmaceutical sectors (e.g., culture system).
• Societal Importance - The broader implications extend to improving patient outcomes and quality of care (e.g., mesothelial surface).
• Link to Scientific Advancements - The use of in vitro cultivation techniques continues to advance our understanding of cell communication (e.g., corning 10-013-CV).