JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:34 min • April 30th, 2023
Otrzewna, czyli błona wyściełająca jamę brzuszną, składa się z komórek międzybłonka otrzewnej wspartych na warstwie włóknisto-naczyniowej tkanki łącznej. Przerzuty komórek raka jajnika przylegają do tej wyściółki otrzewnej i namnażają się w narośla rakowe.
Aby modelować przerzuty raka jajnika, zacznij od pobrania ludzkich fibroblastów do stożkowej rurki i wymieszaj je z kolagenem - białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej. Umieść zawiesinę na szalce hodowlanej. Inkubuj, aby ułatwić krzepnięcie macierzy kolagenowej w celu osadzenia fibroblastów i naśladowania tkanki łącznej otrzewnej.
Następnie dodaj zawiesinę komórek międzybłonka na warstwę fibroblast-kolagen. Inkubuj płytkę, aby komórki międzybłonka mogły przylegać i tworzyć monowarstwę na powierzchni warstwy fibroblast-kolagen. Ta organotypowa hodowla 3D naśladuje teraz skład i architekturę wyściółki otrzewnej in vivo.
Na koniec wysiewaj tę organotypową kulturę komórkami raka jajnika i inkubuj przez pożądany czas. Komórki raka jajnika uwalniają pewne cząsteczki sygnałowe, które zmieniają warstwę międzybłonka, zwiększając adhezję i inwazję komórek rakowych, naśladując warunki przerzutowe in vivo.
Aby uwolnić normalne fibroblasty sieci z hodowli, przepłucz kolbę hodowlaną 10 mililitrami PBS, a następnie 3 mililitrami trypsyny przez nie więcej niż 5 minut. Gdy komórki się odłączą, zneutralizuj trypsynę co najmniej trzykrotną objętością pożywki dla pełnego wzrostu i przenieś komórki do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w 5 mililitrach pełnej pożywki wzrostowej. Następnie policz komórki i rozcieńcz je do 2 do 4 razy 10 do trzeciego fibroblastu na 100 mikrolitrów pełnego stężenia pożywki.
Następnie dodaj 0,5 mikrograma na 100 mikrolitrów kolagenu ze szczurzego ogona I do komórek i umieść 100 mikrolitrów komórek na studzienkę na czarną, przezroczystą 96-dołkową płytkę. Następnie przenieść płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych na co najmniej 4 godziny lub do momentu, gdy komórki przylegają do powierzchni płytki. Podczas gdy normalne fibroblasty sieci osiadają, odłącz HPMC od kolb hodowlanych i rozcieńcz te komórki do 1 do 2 razy 10 do czwartego HPMC na 50 mikrolitrów pełnej pożywki wzrostowej.
Następnie dodaj 50 mikrolitrów HPMC na studzienkę do dołączonych normalnych fibroblastów sieci i włóż płytkę z powrotem do inkubatora hodowli komórkowych na co najmniej 18 godzin przed użyciem eksperymentalnym. Następnego dnia należy wysiać 3D organotypowe kokultury z GFP wykazujące ekspresję komórek raka jajnika z 80% do 90% zlewającej się hodowli w odpowiednim rozcieńczeniu dla pożądanego dalszego testu.