$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ludzkie pierwotne komórki międzybłonka (HPMC) wyściełają wiele narządów trzewnych, takich jak sieć lub warstwa tkanki tłuszczowej obecna w jamie otrzewnej.
Aby wyizolować komórki międzybłonka, zacznij od zanurzenia ludzkiej próbki sieci w odpowiednim buforze w celu usunięcia nadmiaru czerwonych krwinek lub erytrocytów. Następnie umieść sieć w szklanym naczyniu i zmiel ją na kawałki. Powoduje to dysocjację tkanki, uwalniając HPMC wraz z zanieczyszczającymi krwinkami czerwonymi.
Przenieś kawałki do stożkowej rurki i pozwól im pozostać nieruchomo przez żądany czas. Zmielona tkanka bogata w tłuszcz o niskiej gęstości unosi się do góry, podczas gdy gęste składniki komórkowe osiadają na dole. Następnie odessać ciecz na dole, zawierającą HPMC i RBC, do świeżej probówki.
Odwirować w celu zebrania komórek. Usunąć supernatant zawierający bufor. Zawiesić osad w pożywce wzrostowej międzybłonka i inkubować przez pożądany czas. Pożywka ułatwia selektywny wzrost HPMC w stosunku do erytrocytów.
Obserwuj komórki za pomocą mikroskopu świetlnego, aby potwierdzić wzrost ludzkich komórek międzybłonka w kształcie prostopadłościanu.
Po pobraniu chirurgicznej próbki ludzkiej sieci należy natychmiast zanurzyć próbkę w PBS o temperaturze pokojowej. W ciągu 2 godzin od zanurzenia przenieś sieć do 50-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej 20 mililitrów świeżego PBS. Przenieś pozostały płyn do płukania PBS zawierający pierwotne ludzkie komórki międzybłonka lub HPMC i czerwone krwinki do nowej 50-mililitrowej stożkowej probówki i odwiruj komórki.
Następnie wlej zawartość probówki do 10-centymetrowego sterylnego naczynia hodowlanego i użyj dwóch skalpeli, aby zmielić tkankę na 5 milimetrów sześciennych kawałków. Aby wyizolować pierwotne ludzkie komórki międzybłonka lub HPMC, przenieś kawałki sieci do 50-mililitrowej stożkowej rurki i odczekaj 1 minutę, aż stałe kawałki wypłyną na górę. HPMC osiądzie na dnie probówki z czerwonymi krwinkami.
Za pomocą pipety przenieś płyn do płukania PBS zawierający komórki międzybłonka i krwinki czerwone do probówki zawierającej granulowane komórki i odwiruj komórki. Następnie dodaj 20 mililitrów świeżego PBS do sieci i zbierz HPMC i RBC zawierające PBS jeszcze trzy razy, jak właśnie wykazano w przypadku oryginalnych granulowanych komórek.
Po ostatnim wirowaniu umieść komórki w kolbie o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych w 15 mililitrach pełnej pożywki wzrostowej. Aby wyizolować dodatkowy HPMC z próbki sieci należy wstrząsnąć pozostałą tkanką stałą w 20 mililitrach PBS przy 200 obr./min i 37 stopniach Celsjusza. Po 10 minutach odstaw próbkę na 1 minutę, aby tkanka stała mogła wznieść się do górnej części probówki.
Następnie zbierz HPMC i RBC z dna probówki, jak pokazano poniżej. Teraz odwiruj komórki z wtórnego prania i umieść je w osobnej kolbie o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych w 15 mililitrach pełnego podłoża wzrostowego. Aby wyizolować pozostałe HPMC, potrząsaj tkanką przez kolejne 10 minut, tym razem w mieszance PBS i 10 mililitrów trypsyny-EDTA, a następnie umieść te HPMC i RBC w kolbie o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych.
Następnie inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w wilgotnym środowisku. Karmienie posianych komórek 15 mililitrami świeżej, pełnej pożywki w dniach 3 i 5 bez usuwania zużytej pożywki. HPMC można zidentyfikować po ich prostopadłościennym kształcie i ekspresji cytokeratyny-8 i wimentyny.