Obrazowanie immunofluorescencyjne w całości: technika utrwalania i barwienia do oceny nienaruszonych organoidów

Organoidy prostaty stanowią przede wszystkim zewnętrzną warstwę komórek nabłonka podstawnego i wewnętrzne warstwy komórek nabłonka światła ułożone wokół centralnego światła.

Obrazowanie w całości pozwala na badanie nienaruszonych organoidów 3D przy zachowaniu ich morfologii i niejednorodności. Aby rozpocząć barwienie, potraktuj organoidy odpowiednim utrwalaczem, aby zablokować ich składniki komórkowe na miejscu, zachowując je w ten sposób. Umyć próbkę, aby usunąć nadmiar utrwalaczy.

Inkubować z koktajlem roztworu blokującego i barwnika barwiącego DNA. Białka w roztworze blokującym biernie wiążą się z niespecyficznymi miejscami komórek i redukują wszelkie zabarwienia tła. Jednocześnie barwnik barwiący DNA barwi jądra komórkowe.

Dodaj dwa zestawy przeciwciał pierwszorzędowych ukierunkowanych na określone antygeny ulegające ekspresji przez dwie składowe populacje komórek. Inkubować z dwoma różnymi przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z barwnikiem fluorescencyjnym, które wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi. Umyj próbkę w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych przeciwciał.

Zanurzaj barwione organoidy sekwencyjnie w rosnących stężeniach roztworów cukru zawierających środki powierzchniowo czynne, aby poprawić przezroczystość tkanek bez naruszania architektury organoidów. Zabieg ten zwiększa głębokość obrazowania próbki.

Zamontuj organoidy na szkiełku mikroskopowym z przekładkami, aby zachować ich morfologię 3D podczas obrazowania. Użyj mikroskopu konfokalnego, aby obserwować emisje fluorescencji z populacji komórek podstawowych i świetlnych rozmieszczonych wokół centralnego światła.

Aby przeprowadzić barwienie immunofluorescencyjne organoidów prostaty w całości, najpierw dodaj 500 mikrolitrów 4% paraformaldehydu do PBS. Inkubować organoidy przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Po umyciu osadu zgodnie z opisem w protokole tekstowym, dodać 1 mikrogram na mililitr barwnika DAPI w roztworze blokującym i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Chronić próbkę przed światłem podczas inkubacji od tego etapu. Po odwirowaniu organoidów, jak poprzednio, dodać przeciwciało pierwszorzędowe i roztwór blokujący, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając.

Ponownie otocz organoidy i umyj je 1 mililitrem PBS przez 15 minut, delikatnie wstrząsając. Powtórz tę procedurę prania dwa razy. Następnie dodać przeciwciało drugorzędowe i roztwór blokujący i inkubować przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając. Po inkubacji osadzać organoidy i myć je jeszcze dwa razy. Dodaj 1 mililitr 30% sacharozy w PBS z 1% Triton X-100 do granulowanych organoidów. Następnie inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym potrząsaniem.

Po ponownym granulowaniu organoidów dodaj 1 mililitr 45% sacharozy w PBS z 1% Triton X-100 i delikatnie wstrząsaj przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie powtórz procedurę, z wyjątkiem dodania 1 mililitra 60% sacharozy w PBS z 1% Triton X-100. Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć 95% supernatantu. Obserwować osad w świetle UV, aby upewnić się, że nie został utracony podczas usuwania supernatantu. Osad staje się luźniejszy wraz ze wzrostem stężenia sacharozy. Przenieść od 10 do 20 mikrolitrów pozostałej zawiesiny do komorowego szkiełka nakrywkowego i przystąpić do mikroskopii konfokalnej.