Dzielenie sferoid w celu hodowli i wysyłki: procedura rozmnażania i przenoszenia sferoid z guza neuroendokrynnego jelita cienkiego

Sferoidy to hodowle in vitro komórek, które same się agregują, tworząc trójwymiarowe struktury sferyczne. Aby rozmnażać sferoidy guza, zacznij od sferoid hodowanych w odpowiedniej macierzy zewnątrzkomórkowej lub ECM, zawartej na płytce hodowlanej.

Rozetrzeć za pomocą mikropipety, aby mechanicznie złamać ECM i poluzować sferoidy. Przenieść mieszaninę sferoidy i ECM do probówki mikrowirówkowej.

Odwirować z niską prędkością, aby granulować sferoidy i oddzielić je od ECM w supernatancie. Zużyty supernatant zawierający ECM należy wyrzucić. Przenieść probówkę zawierającą osad sferoidalny na lód, aby zapobiec zestaleniu się ECM podczas kolejnych etapów.

Uzupełnij osad świeżym skroplonym ECM. W przypadku hodowli cząstkowej należy wymieszać zawartość, wielokrotnie pipetując w górę iw dół, aby oddzielić komórki sferoidalne i uwolnić je do zawiesiny.

Umieść tę mieszaninę zawierającą komórki sferoidalne i ECM w świeżym naczyniu hodowlanym. ECM krzepnie, umożliwiając uwięzienie komórek nowotworowych. Dodaj żądane podłoże wzrostowe. Inkubuj, aby ułatwić wzrost uwięzionych komórek w nowe sferoidy.

Do celów wysyłki przenieść mieszaninę sferoidy-ECM do kolby hodowlanej. Pozwól ECM zestalić się i uwięzić sferoidy w środku.

Napełnić kolbę pożywką wzrostową, aby uniknąć ścinania komórek i utrzymać żywotność sferoid. Przenieś kolbę do paczki wysyłkowej.

Mechanicznie rozbij ECM za pomocą pipety P1000 i przenieś ją do sterylnej rurki o średnicy 1,5 milimetra. Odwirować probówkę o masie 1 000 x g w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie usuń cały supernatant i umieść probówkę na lodzie. Dodać dwa do czterech razy większą objętość nowego ECM do granulki i wymieszać zawartość probówki, pipetując w górę i w dół 10 razy, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.

Przenieść od 5 do 20 mikrolitrów ECM w mieszaninie SBNET na nową płytkę 96-dołkową i pozwolić ECM na zestalenie się. Następnie przykryj zestalony ECM nową pożywką SBNET i umieść płytkę w inkubatorze. W przypadku wysyłki sferoid SBNET do innego laboratorium, należy przenieść sferoidy z nowym ECM do kolby T25 i pozwolić ECM na zestalenie się. Napełnij kolbę podłożem sferoidalnym SBNET, mocno zakręć nakrętkę i przygotuj paczkę wysyłkową.