JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:53 min. • April 30th, 2023
Wstępna obróbka skrawków tkanek zatopionych w parafinie lub FFPE utrwalonych w formalinie ułatwia ekspozycję kwasów nukleinowych i umożliwia wiązanie znakowanych sond z sekwencją docelową podczas późniejszej hybrydyzacji in situ. Ponadto obróbka wstępna pomaga utrzymać integralność kwasów nukleinowych w komórkach i ogólną morfologię tkanek.
Na początek weź szklane szkiełko z odparafinowaną i ponownie uwodnioną sekcją tkanki FFPE, która Cię interesuje. Potraktuj tkankę nadtlenkiem wodoru o odpowiednim stężeniu i inkubuj.
Nadtlenek wodoru nieodwracalnie dezaktywuje endogenną peroksydazę, która jest fizjologicznie obecna w komórkach. Ten proces blokowania eliminuje możliwość wystąpienia niespecyficznych sygnałów tła podczas kolejnych etapów hybrydyzacji.
Następnie zanurz wycinek tkanki w podgrzewanej kąpieli zawierającej odpowiedni bufor do pobierania antygenu. Inkubuj przez żądany czas. Wysoka temperatura rozszczepia indukowane utrwalaczem chemiczne wiązania krzyżowe w białkach i kwasach nukleinowych, wystawiając zdemaskowane epitopy na działanie sond podczas późniejszego znakowania.
Na koniec potraktuj próbkę odpowiednim roztworem proteazy. Inkubować w środowisku o kontrolowanej wilgotności. Proteazy zwiększają dostępność RNA, ułatwiając określonym sondom dotarcie do sekwencji docelowej w kolejnych etapach hybrydyzacji.
Umyj sekcję wodą, aby usunąć wszelkie pozostałości proteaz. Użyj wstępnie poddanego obróbce przekroju tkanki do chromogennej hybrydyzacji RNA in situ.
Aby zablokować aktywność peroksydazy na szkiełkach z odcinkami tkanek uprzednio odparafinowanymi i umieszczonymi w stojaku na szkiełka, dodaj 4 do 6 kropli nadtlenku wodoru do każdego szkiełka, tylko tyle, aby pokryć próbkę, i inkubować je przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka dwa razy przez 2 minuty w wodzie destylowanej o temperaturze pokojowej. Aby przełamać więzy tkankowe RNA i skrawki tkanki, najpierw usuń folię aluminiową z wrzącego TRR1x za pomocą pazura i przestań mieszać.
Zanurz stojak na slajdy powoli i bardzo ostrożnie. Ponownie przykryj zlewkę folią aluminiową i inkubuj przez 15 minut. Użyj pazura, aby natychmiast przenieść gorący ruszt do szkiełka do kąpieli destylowanej i myć go przez 2 minuty. Następnie umyj szkiełka w świeżym 100% etanolu przez 2 minuty i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na 2 minuty.
Następnie użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby narysować barierę wokół każdej próbki i pozwól jej wyschnąć przez co najmniej 5 minut. W celu trawienia proteazy umieść szkiełka na tacy kontrolującej wilgotność i dodaj około 4 krople Protease Plus na próbkę. Przykryj blachę pokrywką i włóż ją do piekarnika hybrydyzacyjnego na 30 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza.
Wyjmij blachę z piekarnika i wyjmij ruszt przesuwny. Pracując pojedynczo, szybko usuń nadmiar płynu i umieść szkiełko w stojaku na szkiełka zanurzonym w naczyniu do barwienia wypełnionym wodą destylowaną. Myć szkiełka dwa razy przez 2 minuty w wodzie destylowanej o temperaturze pokojowej przy stałym mieszaniu.