JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:26 min • April 30th, 2023
Aby wykryć określoną sekwencję RNA w komórce, zacznij od pobrania wycinka tkanki na szklanym szkiełku. Na wycinek tkanki nałożyć odpowiedni bufor hybrydyzacyjny zawierający docelowe sondy RNA.
Sondy te są cząsteczkami RNA w kształcie litery Z, które mają część rozpoznającą cel na jednym końcu i sekwencję ogonową na drugim końcu. Ramię dystansowe łączy te dwa końce.
Teraz inkubuj szkiełko w piecu do hybrydyzacji w optymalnej temperaturze. Sondy RNA w kształcie litery Z wchodzą do komórki i hybrydyzują parami z odpowiednią docelową sekwencją mRNA.
Wyjmij szkiełko z piekarnika. Zanurzyć szkiełko w roztworze myjącym, aby usunąć wszelkie niezwiązane sondy i nadmiar buforu hybrydyzacyjnego.
Następnie dodać roztwór przedwzmacniacza i inkubować. Cząsteczka przedwzmacniacza przyłącza się do sekwencji ogonowej dwóch sąsiednich sond Z. Cząsteczka ta nie wiąże się z pojedynczą sondą Z, zapewniając specyficzność.
Następnie dodać mieszaninę odczynników wzmacniacza i inkubować. Wiele cząsteczek wzmacniacza hybrydyzuje się z pojedynczą sekwencją przedwzmacniacza.
Na koniec oznacz wycinek tkanki żądanymi sondami do znakowania, aby wykryć obecność określonej sekwencji RNA w komórce.
Aby rozpocząć hybrydyzację, dotknij i przesuń szkiełka, aby usunąć nadmiar płynu i umieść je z powrotem w stojaku na szkiełka. Wyjmij wstępnie podgrzaną sondę HPV z piekarnika i dodaj około czterech kropli, aby całkowicie pokryć każdą sekcję. Przykryj blachę pokrywką i wstaw do piekarnika na 2 godziny w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Po zakończeniu inkubacji wyjmij blachę z piekarnika i wyjmij ruszt do slajdów.
Jedno szkiełko na raz, szybko usuń nadmiar płynu i umieść szkiełko w stojaku na szkiełka zanurzonym w naczyniu barwiącym wypełnionym 1x buforem do mycia, myjąc szkiełka przez 2 minuty w temperaturze pokojowej przy stałym mieszaniu i powtórz ze świeżym 1x buforem do mycia. Dotknij i przesuń, aby usunąć nadmiar płynu ze szkiełek i ponownie umieść je w stojaku na slajdy. Dodaj około czterech kropli AMP1 w temperaturze pokojowej na sekcję, aby całkowicie pokryć każdą sekcję. Przykryj blachę pokrywką i wstaw do piekarnika na 30 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza.
Po wyjęciu blachy z piekarnika wyjmij ruszt przesuwny. Pracując pojedynczo, szybko usuń nadmiar płynu i umieść szkiełko w stojaku na szkiełka zanurzonym w naczyniu barwiącym wypełnionym 1x buforem do mycia, myjąc przez 2 minuty w temperaturze pokojowej przy ciągłym mieszaniu i powtórz ze świeżym 1x buforem do mycia.