JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 2:42 min. • April 30th, 2023
Aby wykryć sygnały chromogenne podczas hybrydyzacji RNA, zacznij od pobrania wycinka tkanki na szkiełku podstawowym. Ta sekcja zawiera docelowe RNA, wstępnie zhybrydyzowane z sondą RNA znakowaną peroksydazą chrzanową.
Naniec kilka kropli diaminobenzydyny lub DAB, substratu wykrywającego, na wycinek tkanki i inkubować.
DAB dostaje się do komórki, a enzym peroksydazy chrzanowej utlenia ją, tworząc brązowy osad. Ta reakcja nadaje brązowy kolor określonym sekwencjom RNA w komórce. Komórki, które nie zawierają docelowego RNA, nie będą miały aktywności peroksydazy i pozostaną niezabarwione.
Następnie przeciwbarwić wycinek tkanki hematoksyliną. Hematoksylina wiąże się z DNA i nadaje fioletowy barwnik na wycinku tkanki.
Potraktuj odcinek tkanki wodą amoniakalną - roztworem niebieszczenia. Zmniejsza intensywność fioletowej plamy, sprawiając, że komórki wydają się niebieskie. Ten krok jest niezbędny do wyraźnej wizualizacji brązowych plam wewnątrz komórek.
Teraz zanurz sekcję tkanki w rosnącym stężeniu etanolu, a następnie potraktuj ją ksylenem - rozpuszczalnikiem organicznym. Te kroki odwadniają sekcję tkanki, aby uzyskać lepsze obrazy.
Na koniec uszczelnij szkiełko za pomocą roztworu montażowego i szkiełka nakrywkowego i wizualizuj pod mikroskopem świetlnym. Komórki wykazują punktowe brązowe kropki wskazujące na obecność docelowego RNA.
Dozuj taką samą liczbę kropli każdego roztworu DAB-A i DAB-B do probówki o odpowiedniej wielkości, aby uzyskać około 120 mikrolitrów substratu DAB na sekcję i wir. Wyjmij każde szkiełko, pojedynczo, ze stojaka na szkiełka, a następnie dotknij i przesuń, aby usunąć nadmiar płynu, a następnie umieść je z powrotem w stojaku na szkiełka. Odpipetować około 120 mikrolitrów mieszaniny DAB na każdy fragment tkanki, upewniając się, że skrawki są zakryte. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej i przystąpić do barwienia przeciwstawnego.
Umieść jedną kroplę medium montażowego na szklaną listwę, a następnie umieść listwę na szkiełkach i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Po kilku godzinach przystąp do oceny przy użyciu mikroskopu optycznego, zgodnie z opisem w manuskrypcie.