Wykrywanie sygnału RNA CISH: technika wykrywania sygnałów chromogennych podczas hybrydyzacji RNA in situ w nienaruszonych próbkach tkanek

Aby wykryć sygnały chromogenne podczas hybrydyzacji RNA, zacznij od pobrania wycinka tkanki na szkiełku podstawowym. Ta sekcja zawiera docelowe RNA, wstępnie zhybrydyzowane z sondą RNA znakowaną peroksydazą chrzanową.

Naniec kilka kropli diaminobenzydyny lub DAB, substratu wykrywającego, na wycinek tkanki i inkubować.

DAB dostaje się do komórki, a enzym peroksydazy chrzanowej utlenia ją, tworząc brązowy osad. Ta reakcja nadaje brązowy kolor określonym sekwencjom RNA w komórce. Komórki, które nie zawierają docelowego RNA, nie będą miały aktywności peroksydazy i pozostaną niezabarwione.

Następnie przeciwbarwić wycinek tkanki hematoksyliną. Hematoksylina wiąże się z DNA i nadaje fioletowy barwnik na wycinku tkanki.

Potraktuj odcinek tkanki wodą amoniakalną - roztworem niebieszczenia. Zmniejsza intensywność fioletowej plamy, sprawiając, że komórki wydają się niebieskie. Ten krok jest niezbędny do wyraźnej wizualizacji brązowych plam wewnątrz komórek.

Teraz zanurz sekcję tkanki w rosnącym stężeniu etanolu, a następnie potraktuj ją ksylenem - rozpuszczalnikiem organicznym. Te kroki odwadniają sekcję tkanki, aby uzyskać lepsze obrazy.

Na koniec uszczelnij szkiełko za pomocą roztworu monta