Osadzanie sferoid 3D w kroplach żelu agarozowego: technika zachowywania sferoid do dalszej analizy

Sferoidy to trójwymiarowe sferyczne agregaty komórkowe in vitro, które naśladują mikrośrodowisko guza in vivo i pomagają badać progresję guza. Aby zachować te sferoidy przez osadzanie, zacznij od pobrania sterylnej probówki zawierającej sferoidy w pożądanym buforze.

Potraktuj sferoidy paraformaldehydem. Paraformaldehyd sieciuje białka komórkowe, powodując stabilizację i zachowanie struktury komórki. Odwirować sferoidy i usunąć supernatant zawierający paraformaldehyd. Ponownie zawiesić osad sferoidalny w buforze.

Następnie przygotuj pożądane stężenie stopionego roztworu żelu agarozowego. Zrób kroplę żelu agarozowego na szkiełku mikroskopowym. Utrzymuj szkiełko na bloku grzewczym, aby uniknąć zestalenia się agarozy.

Za pomocą mikropipety z końcówką z szerokim otworem zebrać sferoidy z probówki. Ostrożnie odpipetować sferoidy do środka kropli żelu agarozowego, nie dotykając szkiełka mikroskopowego. Następnie należy inkubować szkiełko w odpowiedniej temperaturze, aby umożliwić ECM zestalenie się i uwięzienie sferoid w środku.

Delikatnie przenieś półstałą kroplę ze szkiełka mikroskopowego do kasety na tkanki. Osadzone sferoidy należy przechowywać w etanolu do czasu dalszej analizy.

Na początek zamocuj sferoidy w dygestoriach pierwszego dnia, jak opisano w protokole tekstowym. Drugiego dnia umieść żel agarozowy w zlewce wypełnionej wodą w kuchence mikrofalowej, aby go podgrzać, i trzymaj żel w cieple na blacie grzewczym ustawionym na 60 stopni Celsjusza, aż będzie potrzebny.

Umyj sferoidy dwukrotnie w dygestorio, używając 1 mililitra lodowatego 1X PBS na pranie. Następnie odessać większość PBS. Przygotuj końcówkę do pipety o pojemności 20 mikrolitrów, przecinając ją pod kątem, aby uzyskać bardziej spiczastą końcówkę z większym otworem.

Następnie zrób kroplę żelu agarozowego na szkiełku mikroskopowym. Umieść szkiełko na ciepłym bloku grzewczym, aby zapobiec zestaleniu się agarozy. Za pomocą zmodyfikowanej końcówki pipety złap jak najwięcej sferoid w objętości od 15 do 20 mikrolitrów.

Ostrożnie wstrzyknąć sferoidy w środek kropli żelu agarozowego, uważając, aby nie dotknąć szkiełka mikroskopowego. Inkubować w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 stopni przez 5 do 10 minut, aby żel agarozowy stwardniał. Gdy kropla żelu nieco stwardnieje, ale nadal jest dość miękka, użyj skalpela, aby ostrożnie wepchnąć ją ze szkiełka mikroskopowego do plastikowej kasety na chusteczki. Przenieś kasetę z bibułkami do zlewki wypełnionej etanolem i przechowuj w temperaturze pokojowej.