Wytwarzanie macierzy zewnątrzkomórkowej z modelu mysiego: skuteczna procedura przygotowania bezkomórkowej macierzy zewnątrzkomórkowej języka z języka mysiego

Macierz zewnątrzkomórkowa lub ECM - niekomórkowy składnik środowiska tkankowego - składa się ze złożonej sieci białek strukturalnych i regulatorowych oraz polisacharydów wydzielanych przez komórki. ECM zapewnia strukturalne i biochemiczne wsparcie komórkom oraz reguluje ich wzrost.

Aby przygotować macierz zewnątrzkomórkową języka, zacznij od pobrania świeżo zebranego języka myszy. Umyj go etanolem, aby usunąć jego warstwę lipidową.

Następnie poddaj go naprzemiennym cyklom zamrażania i rozmrażania. Zamrażanie sprzyja wewnątrzkomórkowemu tworzeniu się kryształków lodu, podczas gdy rozmrażanie topi kryształki lodu, co powoduje przerwanie błony komórkowej.

Teraz zawieś język w roztworze antybiotyku, aby zahamować rozwój bakterii. Następnie potraktuj narząd hipertonicznym roztworem soli fizjologicznej. W przypadku wysokiego stężenia substancji rozpuszczonej woda wypływa z komórek, powodując ich kurczenie się. Ten krok pomaga w śmierci komórkowej i oderwaniu się od macierzy zewnątrzkomórkowej.

Inkubuj język w niejonowym środku powierzchniowo czynnym. Surfaktant całkowicie rozpuszcza błony komórkowe i jądrowe, ułatwiając uwalnianie zawartości wewnątrzkomórkowej do roztworu.

Na koniec zawiesić język w roztworze zawierającym jony wapnia i magnezu, a następnie poddać go działaniu nukleaz. Jony wapnia i magnezu zwiększają aktywność nukleaz w celu degradacji wolnych kwasów nukleinowych w roztworze.

Zdecelularowaną tkankę języka należy przechowywać w odpowiednim buforze do czasu dalszego przetwarzania.

Po wyizolowaniu języków od myszy poddanych eutanazji zgodnie z protokołem tekstowym, zanurz tkankę w 75% etanolu na 3 minuty. Następnie przenieś każdy język do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej z 1 mililitrem 10-milimolowego sterylnego PBS. Aby przeprowadzić lizę komórek, zamroź języki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na 1 godzinę. Następnie rozmrażaj tkankę w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Powtórz zamrażanie i rozmrażanie jeszcze dwa razy.

Następnie, w 3,5-centymetrowym lub 6-centymetrowym naczyniu hodowlanym zawierającym 75% etanolu, za pomocą igły chirurgicznej załaduj każdy język na kawałek szwu chirurgicznego i małym kawałkiem sterylnej folii aluminiowej owiń koniec szwu. W naczyniu hodowlanym o średnicy 3,5 centymetra lub 6 centymetrów użyj 3 mililitrów PBS do płukania każdego języka przez 30 sekund. Następnie w butelce z szerokim otworem przygotuj 90 mikrogramów na mililitr ampicyliny w 250 mililitrach sterylnej ultraczystej wody i dodaj mieszadło.

Opuść do 5 języków do butelki, aż znajdą się około 2 centymetry od dna i dokręć nakrętkę, pozostawiając część szwu na zewnątrz butelki. Umieść butelkę na mieszadle magnetycznym na 12 godzin. Następnie, po inkubacji, przygotować 250 mililitrów po 90 mikrogramów na mililitr ampicyliny w sterylnym 1 molowym chlorku sodu. Przenieś języki i mieszadło do butelki i zakręć nakrętkę. Umieść butelkę na mieszadle magnetycznym na 24 godziny.

Aby przeprowadzić lizę komórek, przygotuj 90 mikrogramów na mililitr ampicyliny w 250 mililitrach sterylnego 2% Triton X-100 w PBS. Przenieś języki i mieszadło do butelki i dokręć nakrętkę. Następnie mieszaj butelkę przez 48 godzin. Po przygotowaniu chlorku wapnia i chlorku magnezu z ampicyliną, przenieś chusteczkę i kostkę mieszającą do butelki i mieszaj butelkę przez 24 godziny.

Przygotować 1 mililitr 300 mikromolowej DNazy w HBSS w jednej probówce mikrowirówkowej dla każdej próbki języka. Przenieś języki do rurek z tą samą częścią szwu zwisającą na zewnątrz. Następnie inkubuj tkankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Przenieść próbki z powrotem do butelki z szerokim otworem sterylnego PBS z ampicyliną i umieścić ją na mieszadle na 24 godziny. Po inkubacji należy przechowywać przygotowaną macierz zewnątrzkomórkową języka (TEM) w sterylnym PBS w temperaturze 4 stopni Celsjusza do czasu użycia.