JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 4:55 min • April 30th, 2023
Inwazja okołonerwowa lub PNI odnosi się do migracji komórek rakowych wzdłuż nerwów, a następnie ich inwazji do krocza - odpowiedniego mikrośrodowiska dla wzrostu raka i przerzutów.
Aby naśladować PNI in vitro, zacznij od dodania kropli macierzy zewnątrzkomórkowej lub zawiesiny ECM na szalkę hodowlaną tak, aby przybrała kształt półkuli. Teraz inkubuj naczynie hodowlane, aby wzmocnić strukturalne i funkcjonalne cechy rusztowania 3D.
Następnie ostrożnie umieść wstępnie zebrany zwój korzenia grzbietowego lub DRG, skupisko neuronów czuciowych, w środku półstałej kropli ECM. Inkubować w celu osadzenia DRG w kropli ECM.
Następnie dodaj odpowiednią pożywkę wzrostową i inkubuj. ECM uzupełniony składnikami odżywczymi sprzyja kiełkowaniu DRG w małe wypustki nerwowe zwane neurytami, które wyrastają promieniście w kierunku obwodu kropli.
Usunąć zużytą pożywkę, aby przygotować kroplę ECM do kolejnego testu. Nasiona fluorescencyjnie zabarwione przylegające komórki rakowe nad kropelką. Ze względu na półkulisty kształt komórki rakowe przewracają się i osiadają wzdłuż obwodu kropelki.
Inkubuj naczynie hodowlane, aby umożliwić interakcję komórka rakowa z neurytem. Oglądane pod mikroskopem fluorescencyjnym można zobaczyć, jak komórki rakowe podążają obok neurytów i migrują w kierunku DRG, potwierdzając inwazję okołonerwową.
Aby przygotować półstałe kropelki matrycy, należy przenieść jedną szklaną płytkę dna z lodu na blok lodu pod mikroskopem operacyjnym. Umieść końcówkę pipety o pojemności nie większej niż 10 mikrolitrów bezpośrednio na szkle pod kątem 45 stopni i ostrożnie dozuj 1.5-mikrolitrową kroplę matrycy na szkło. Powoli odsuń końcówkę pipety od szklanki, gdy matryca zazębi się z płytką.
Umieść jedną kroplę matrycy na każdym z czterech rogów płytki i przenieś płytkę na powierzchnię o temperaturze pokojowej na około 1 minutę. Gdy matryca lekko się usztywni, umieść płytkę z powrotem w bloku lodu i za pomocą zamkniętych mikroskopijnych kleszczyków delikatnie zgarnij DRG lewą ręką.
Prawą ręką ostrożnie przenieś tkankę nerwową na końcówkę igły 21G i użyj igły, aby delikatnie wprowadzić DRG do środka kropli matrycy. DRG powinien łatwo uwalniać się do matrycy w celu centralnego pozycjonowania za pomocą igły.
Po włożeniu kawałka DRG do każdej z czterech kropel, umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 3 minuty. Po osadzeniu wszystkich DRG należy trzymać płytki pojedynczo pod niewielkim kątem i powoli dodawać do płytek 4 mililitry DMEM uzupełnionego 10% FBS, tak aby podłoże tylko stopniowo stykało się z jednostkami matrycy-DRG.
Umieść płytki z powrotem w inkubatorze na kolejne 48 do 72 godzin. Gdy neuryty osiągną co najmniej 75% drogi do krawędzi matrycy, należy odessać pożywkę ze studzienek bez usuwania jednostek matrycy-DRG. Następnie, za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów z płynnym spustem, umieść dwie krople po 3 razy 10 do piątej komórki na mililitr pożywki na każdym teście matrycowym DRG i włóż płytki z powrotem do inkubatora. Po godzinie delikatnie dodaj 4 mililitry DMEM z 10% FBS wzdłuż bocznej ścianki szklanej płytki dolnej i włóż płytki z powrotem do inkubatora do czasu ich następnej oceny mikroskopowej.