Test dyskryminacji populacji po stronie raka: metoda izolowania rakowych komórek macierzystych za pomocą testu wypływu barwnika Hoechsta

Guz zawiera niewielką frakcję komórek macierzystych znanych jako populacja boczna. Komórki te są chemooporne, co czyni je odpowiedzialnymi za nawrót raka.

Aby wyizolować populację boczną komórek rakowych, należy rozpocząć od dodania Hoechst - fluorescencyjnego roztworu barwnika - do fiolki zawierającej zawiesinę komórek rakowych. Wewnątrz normalnych komórek rakowych cząsteczki Hoechst dostają się do jądra i wiążą się z regionem bogatym w A-T w DNA, co prowadzi do wysokiej fluorescencji w tych komórkach.

W przeciwieństwie do tego, populacja boczna zawiera wysokie stężenie transporterów ABC - pomp wypływowych, które szybko usuwają cząsteczki barwnika z komórki. Ten aktywny wypływ cząsteczek barwnika sprawia, że populacja boczna fluoryzuje z niską intensywnością.

Teraz weź kolejną fiolkę z komórkami rakowymi leczonymi Hoechst i dodaj do niej Verapamil. Ta fiolka działa jako kontrola, ponieważ Verapamil blokuje transportery ABC. Ten etap powoduje zmniejszenie wypływu Hoechst i zatrzymanie barwnika wewnątrz bocznych komórek populacyjnych.

Następnie przeciwbarwić komórki w obu fiolkach za pomocą jodku propydyny. Jodek propidyny dostaje się wyłącznie do jądra martwych komórek i interkaluje się między zasadami DNA. Prowadzi to do wysokiej fluorescencji w martwych komórkach.

Na koniec posortuj komórki za pomocą aktywowanego fluorescencją sortera komórek lub FACS. FACS oddziela wysoce fluorescencyjne, zatrzymujące Hoechsta komórki nowotworowe i martwe komórki od niskofluorescencyjnych komórek bocznych populacji.

Aby wybrać boczną populację nowotworowych komórek macierzystych za pomocą testu wypływu barwnika Hoechsta, najpierw oznacz jedną stożkową rurkę "Hoechst" i jedną "Hoechst i Werapamil". Następnie przemyj hodowlę komórkową HNSCC sterylnym PBS, a następnie dodaj 1 mililitr trypsyny-EDTA. Po 3 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza przerwij reakcję ze świeżą pożywką do hodowli komórkowych i policz komórki. Rozcieńczyć kulturę do 1 razy 10 do siódmych komórek na mililitr w kompletnej pożywce rodzicielskiej linii komórkowej.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów do probówki "Hoechst i Werapamil" i 4 mililitry komórek do probówki "Hoechst". Następnie delikatnie wymieszaj 10 mikrolitrów 5-milimolowego roztworu chlorowodorku Verapamil z próbką "Hoechst i Verapamil", a następnie 5 mikrolitrów Hoechst na 1 razy 10 do szóstych komórek do obu probówek. Następnie przykryj próbki folią aluminiową i umieść je w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 90 minutach z delikatnym mieszaniem co 15 minut, odwirować probówki i ponownie zawiesić granulki w 2 mililitrach PBS.

Po drugim odwirowaniu ponownie zawiesić granulki "Hoechst i Werapamil" w 500 mikrolitrach jodku propidyny w PBS, a osadki "Hoechst" w 4 mililitrach tego samego. Teraz przefiltruj próbki przez sitka o średnicy 70 mikronów do probówek FACS, aby usunąć wszelkie osady i umieść próbki na lodzie chronionym przed światłem. Następnie załaduj próbkę "Hoechst" do cytometru przepływowego i otwórz okno "Arkusz globalny" w oprogramowaniu cytometru przepływowego. Kliknij "Wykres punktowy", aby utworzyć wykres w globalnym arkuszu roboczym i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać parametry rozproszenia do przodu i z boku.

Utwórz boczny rozrzut szeroki za pomocą bocznego wykresu punktowego o wysokości rozproszenia w ten sam sposób, a następnie kliknij "Brama wielokątna", aby utworzyć region P1 na drugim wykresie, aby zaznaczyć pojedyncze komórki i rozróżnić dublety. Następnie utwórz czerwony obszar Hoechsta za pomocą niebieskiego wykresu kropkowego obszaru Hoechsta i kliknij prawym przyciskiem myszy komórki, aby podświetlić populację P1. Następnie utwórz region P2, aby wybrać ujemną populację komórek po stronie barwnika Hoechsta, która pojawia się jako broń boczna po lewej stronie głównej populacji komórek i zbierz 10 000 zdarzeń próbki "Hoechst".

Aby potwierdzić, że bramka P2 reprezentująca populację boczną jest prawidłowo umieszczona, zbierz również 10 000 próbnych zdarzeń "Hoechst i Verapamil". Populacja boczna powinna zniknąć. Następnie posortuj boczną populację komórek ujemnych barwnika Hoechst do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 1 mililitr kompletnej pożywki z komórek macierzystych podobnych do raka. Pod koniec sortowania odwiruj komórki i ponownie zawieś boczny osad populacji w 1 mililitrze świeżej, kompletnej pożywki z komórek macierzystych podobnych do raka. Następnie policz komórki i wysiew je w odpowiedniej liczbie do nowej kolby do hodowli komórkowej.