Bezkomórkowe przygotowanie rusztowania przełyku świni: technika generowania rusztowania bezkomórkowego z przełyku świni

Bezkomórkowe rusztowania pochodzące z macierzy zewnątrzkomórkowej określonej tkanki naśladują swoje natywne mikrośrodowisko zewnątrzkomórkowe. Rusztowania te zachowują swoją integralność strukturalną i skład biochemiczny oraz służą jako obiecujące platformy dla inżynierii tkankowej.

Aby przygotować rusztowanie przełyku świń bez komórek, zacznij od świeżo wyciętego przełyku świni. Przeciąć przełyk wzdłuż i przepłukać go odpowiednim buforem, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Następnie zabezpiecz przełyk powierzchnią błony śluzowej, najbardziej wewnętrzną warstwą, skierowaną do góry.

Oddziel błonę śluzową od leżącej pod nią błony podśluzowej na jednym końcu przełyku. Wypreparuj przełyk wzdłużnie wzdłuż luźnej tkanki łącznej błony śluzowej zwanej blaszką właściwą, aby całkowicie oddzielić powierzchnię błony śluzowej od leżącej poniżej błony podśluzowej.

Ponadto należy wyciąć proksymalne i dystalne obszary błony śluzowej, które zawierają większą gęstość gruczołów podśluzówkowych i grubszą warstwę blaszki właściwej. Pokrój tkankę błony śluzowej na kawałki o jednakowej wielkości.

Potraktuj tkankę hipertonicznym roztworem soli fizjologicznej uzupełnionym antybiotykami. Antybiotyki pomagają zapobiegać rozwojowi bakterii. Przy wysokim stężeniu substancji rozpuszczonej woda wydostaje się z komórek i powoduje ich kurczenie się. Ten krok dodatkowo pomaga w śmierci komórkowej i oderwaniu się od macierzy zewnątrzkomórkowej.

Teraz delikatnie oderwij rozluźniony nabłonek od leżącej pod nim tkanki. Opłucz tkankę buforem, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe. Na koniec inkubuj tkankę w glicerolu, który dodatkowo ułatwia decelularyzację tkanek poprzez odwadnianie i lizę komórek, zachowując jednocześnie integralność błony podstawnej.

Aby przygotować bezkomórkowe rusztowania przełyku świni, zacznij od użycia nożyczek i pęsety, aby rozciąć przełyk świni wzdłużnie. Następnie umyj przełyk w sterylnym garnku o pojemności 180 mililitrów zawierającym 100 mililitrów sterylnego PBS przez 10 minut, delikatnie potrząsając, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.

Podczas płukania tkanki spryskaj korkową deskę do wycinki 70% etanolem. Gdy korek wyschnie, przypnij przełyk do deski błoną śluzową do góry. Teraz użyj sterylnej pęsety, aby chwycić powierzchnię błony śluzowej na jednym końcu przełyku i odciągnij tkankę od deski, aby oddzielić błonę śluzową od leżącej pod nią błony podśluzowej.

Następnie, za pomocą sterylnego ostrza skalpela, rozetnij przełyk wzdłuż blaszki właściwej, usuwając szpilki w miarę postępu sekcji, aby umożliwić usunięcie błony śluzowej. Wyrzuć leżącą pod spodem błonę śluzową i za pomocą skalpela pokrój pozostałą błonę śluzową na 5-centymetrowe kwadratowe kawałki. Umyj kawałki w 150 mililitrach sterylnego PBS z delikatnym mieszaniem, jak pokazano.

Po pięciu minutach przenieś tkankę do 180-mililitrowego garnka zawierającego 150 mililitrów 1 molowego roztworu chlorku sodu uzupełnionego antybiotykami w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 72 godzinach przenieś tkankę do 150 mililitrów sterylnego PBS, w którym to momencie nabłonek zacznie widocznie oddzielać się od tkanki leżącej pod spodem.

Użyj sterylnych kleszczy i ostrza skalpela, aby usunąć odklejający się nabłonek i umieść pozostałą tkankę w świeżym garnku ze 150 mililitrami sterylnego PBS z trzema pięciominutowymi płukaniami z delikatnym mieszaniem. Tkanka musi być teraz przechowywana w glicerolu przez co najmniej cztery miesiące, aby w pełni wysterylizować rusztowanie.