Wysokowydajna, zautomatyzowana platforma do rozwoju linii komórkowych do produkcji leków białkowych

Ogólnym celem tej procedury jest opracowanie linii komórkowych do produkcji leków biologicznych o klonalności i wysokiej wydajności. Osiąga się to poprzez pierwszą transekcję, komórkę gospodarza z DNA, kodującą gen będący przedmiotem zainteresowania. Kolejnym krokiem procedury jest wyizolowanie klonów o wysokiej produkcji na podstawie faktów, a następnie udokumentowanie tworzenia kolonii za pomocą imagera selekcji klonów.

Ostatnim krokiem jest przesiewanie i wybieranie wysoce produktywnych klonów. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wskazują na wytwarzanie przeciwciał w ciągłych i karmionych hodowlach okresowych za pomocą HPLC z odwróconą fazą. Wideo. Demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ sortowanie faktów i kroki pcan 80 dgl są trudne do nauczenia, ponieważ w te procedury zaangażowana jest złożona konfiguracja, następujący naukowcy z laboratorium zademonstrują te procedury transfekcji efektu komórki gospodarza, sortując Jasona Sandersa do dokumentacji tworzenia kolonii i Russella Kan do pobierania próbek tekanu.

I Eliza: Aby rozpocząć tę procedurę na dzień przed transfekcją, wysiewaj komórki gospodarza w kolbie do hodowli komórkowej w 15 mililitrach wzrostu. Średni. Następnego dnia inkubować komórki w inkubatorze z dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 7,5%, przygotować kompleksy transfekcyjne, najpierw rozcieńczyć osiem mikrogramów, DNA w 800 mikrolitrach pożywki wzrostowej bez surowicy w sterylnej mikroprobówce wirówkowej, delikatnie wymieszać. Następnie rozcieńczyć wargę o pojemności 40 mikrolitrów w 800 mikrolitrach pożywki wzrostowej bez surowicy w tubie polistyrenowej.

Dodać rozcieńczone DNA do rozcieńczonej lipopektaminy. Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby przygotować komórki gospodarza do transfekcji. Usuń pożywkę wzrostową z komórek i zastąp ją 6,4 mililitra pożywki wzrostowej bez surowicy.

Dodać 1,6 mililitra kompleksów transfekcyjnych do kolby. Delikatnie wymieszać, kołysząc kolbą. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla przez sześć godzin.

Po sześciu godzinach dodaj osiem mililitrów pożywki wzrostowej do kolby i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla przez noc następnego dnia. Usunąć pożywkę przez aspirację i dodać świeżą pożywkę wzrostową do kolby. Po całonocnej inkubacji ponownie inkubować komórki przez noc.

Zastąp pożywkę wzrostową selekcją. Średni. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla przez dwa do trzech tygodni. Dwa do trzech tygodni po transfekcji komórki są gotowe do klonowania za pomocą aktywowanej cytometrią przepływową sortowania komórek z kolby i wirowania z prędkością 800 obr./min przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Ponownie zawiesić komórki w pożywce selekcyjnej, uzupełnionej 2% albuminą surowicy bydlęcej. Następnie dodaj znakowane fluorescencyjnie przeciwciało anty-ludzkie IgG. Dodać rozcieńczenie od jednego do 20 inkubować na lodzie przez 15 do 30 minut, a następnie dwukrotnie przemyć zimnymi komórkami ponownego zawieszenia PBS w jednym XPBS w probówce polipropylenowej.

Przykład barwionych komórek pokazano na tym rysunku do aseptycznego sortowania na faksie BD, przygotuj 96-dołkową płytkę do hodowli komórek, która zawiera 200 mikrolitrów pożywki selekcyjnej w każdym dołku. W asepcie załaduj rurkę komórkami i przeanalizuj fakty dotyczące BD. Aria, zapisz wyniki odpowiednio dla komórek barwionych i niebarwionych.

Ustaw bramki i ustawienia, aby sortować pojedyncze komórki o pożądanym profilu barwienia fluorescencyjnego na płytce 96-dołkowej, inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa tygodnie w dniu zero, dniu trzecim, siódmym i dniu 13 po sortowaniu faktów Udokumentuj tworzenie kolonii na płytce 96-dołkowej na imagerze do wyboru klonów, aby zapewnić wybór klonów pochodzących z pojedynczej komórki do przesiewania i selekcji pod kątem wysokiej produktywności Klonów. Pierwszy dokument położenie próbki na przyjmującej 96-dołkowej płytce testowej. Następnie użyj zrobotyzowanego systemu obsługi cieczy, aby przenieść podwielokrotności supernatantu o pojemności 20 mikrolitrów do każdej studzienki z 96 dołków, produkcja przeciwciał na płytce testowej w próbkach jest analizowana przez kanapkę.

Ludzkie IgG wykrywające ELI SA w systemie obchodzenia się z cieczami w następujący sposób. Najpierw próbki i wzorzec są umieszczane na wstępnie zakodowanych płytkach testowych anty-ludzkich IgG w płaszczu biologicznym. Płytki inkubuje się w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, a następnie trzy płukania PBS.

Następna immuno czysta koza anty-ludzka IgG. HRP dodaje się do płytek w rozcieńczeniu od 1 do 2000, a płytki inkubuje się przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po godzinie płytki myje się trzykrotnie PBS, a następnie dodaje się podłoże A BTS.

Na koniec płytki są czerwone na czytniku płytkowym wykorzystującym absorbancję przy 405 nanometrach do wykrywania. Korzystając z tej zautomatyzowanej platformy, stwierdzono, że powierzchniowy poziom przeciwciał odbity przez barwienie znakowaną fluorescencyjnie anty-ludzką IgG koreluje z produktywnością przeciwciał w komórce. Jak pokazano tutaj dla dwóch najlepszych klonów wygenerowanych z populacji komórek o wysokiej ekspresji przeciwciał powierzchniowych, specyficzna produktywność wahała się od 50 do 70 pikogramów na komórkę dziennie.

W przeciwieństwie do tego, produktywność przeciwciał wynosiła około 20 pikogramów na komórkę dziennie dla dwóch najlepszych klonów wygenerowanych z populacji komórek o niskiej ekspresji przeciwciał powierzchniowych. Co więcej, linie komórkowe opracowane przez sortowanie faktów są bardziej stabilne pod względem produkcji przeciwciał niż te, które zostały sklonowane poprzez ręczne rozcieńczenie ograniczające. Specyficzna wydajność klonu z najwyższej półki, wygenerowanego przez ręczne rozcieńczenie ograniczające, spadła z około 30 PCD do około 10 PCD po hodowli 80 podwojeń komórek.

Z drugiej strony, górny podklon wygenerowany przez drugi klon sortowania faksów był w stanie utrzymać określoną wydajność około 20 PCD dla co najmniej 100 podwojeń komórek. Identyfikacja miejsca integracji transgenu w chromosomie komórkowym za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ wykazała, że klon pierwszy jest mieszaną populacją fenotypu A i fenotypu B.In przeciwieństwie do faktu, że posortowany klon wydawał się być bardziej jednorodną populacją z 99,5% komórek o fenotypie A. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozwijać linie komórkowe do produkcji w celu ochrony białek terapeutycznych.