Name: Wysokowydajna, zautomatyzowana platforma do rozwoju linii komórkowych do produkcji leków białkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną platformę do rozwoju linii komórkowych do produkcji leków białkowych. Wykorzystuje cytometrię przepływową i obrazowanie kolonii, zapewniając wysoką produktywność i stabilność klonów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Transfekcja komórek gospodarza
<ol>
	<li>Wysiać 2 x 10^66 Komórki CHO-DXB11 w kolbie do hodowli komórek Corning T75 w 15 ml pożywki wzrostowej (MEMa z nukleotydami i nukleozydami (Gibco, numer katalogowy 12571), uzupełnionej o 10% scharakteryzowanej płodowej surowicy bydlęcej (cFBS) naświetlanej promieniami γ (HyClone, numer katalogowy SH30071.03) oraz 10 ml/L 45% roztworu glukozy (Sigma, numer katalogowy G8769)) na jeden dzień przed transfekcją.</li>
	<li>W momencie transfekcji przygotować kompleksy transfekcyjne w następujący sposób:
		<ol class="lalpha">
			<li>Rozcieńczać 8 μg DNA w 800 μl pożywki wzrostowej bez surowicy w sterylnej probówce do mikrocentryfugi. Delikatnie wymieszać.</li>
			<li>Rozcieńczyć 40 μl Lipofectamine (Invitrogen 18324012) w 800 μl pożywki wzrostowej bez surowicy w probówce polistyrenowej. </li>
			<li>Dodaj rozcieńczone DNA do rozcieńczonej Lipofectaminy. Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. </li>
		</ol>
	</li>
	<li>Usunąć pożywkę wzrostową z komórek w kolbie T75 i zastąpić ją 6,4 ml pożywki wzrostowej bez surowicy. Do kolby dodać 1,6 ml kompleksów transfekcyjnych. Delikatnie wymieszać, kołysząc płytką.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37°C w CO2 inkubator przez 6 godzin.</li>
	<li>Do kolby dodać 8 ml pożywki wzrostowej i inkubować w 37°C w CO2 inkubator przez noc.</li>
	<li>Usunąć medium poprzez aspirację i dodać do kolby świeże medium wzrostowe. Inkubować komórki w temperaturze 37°C w CO2 inkubator przez noc.</li>
	<li>Należy zastąpić pożywkę wzrostową pożywką selekcyjną (pożywka MEMa bez nukleotydów i nukleozydów (Gibco, numer katalogowy 12561) uzupełniona o 10% dializowanej płodowej surowicy bydlęcej (dFBS) naświetlanej promieniami γ (HyClone, numer katalogowy SH30079.03) oraz 10 ml/l 45% roztworu glukozy (Sigma, numer katalogowy G8769)).</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37°C w CO2 inkubator przez 2-3 tygodnie.</li>
</ol>
2. Klonowanie metodą sortowania komórek aktywowanych za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Odzespój komórki z kolby i odwiruj przy 800 rpm przez 5 minut w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Resuspenduj komórki w medium selekcyjnym uzupełnionym o 2% albuminy surowicy bydlęcej oraz znakowane fluorescencyjnie przeciwciało anty-IgG przeciw ludzkie w rozcieńczeniu 1:20.</li>
	<li>Inkubuj na lodzie przez 15-30 minut, a następnie przemyj dwukrotnie zimnym PBS. Resuspenduj komórki w 1x PBS w probówce polipropylenowej.</li>
	<li>Przygotuj system do aseptycznej sortowności na urządzeniu BD FACSAria. Przygotuj płytkę hodowlano-komórkową 96-dołkową, zawierającą 200 μl medium selekcyjnego w każdym dołku.</li>
	<li>Aseptycznie załaduj probówkę z komórkami i przeanalizuj na urządzeniu BD FACSAria, rejestrując wyniki odpowiednio dla komórek barwionych i niebarwionych.</li>
	<li>Ustaw bramki i parametry w celu sortowania pojedynczych komórek o pożądanym profilu barwienia fluorescencyjnego do płytki (płytek) 96-dołkowych.
		<ol class="lalpha">
			<li>Komórki transfekowane są najpierw analizowane pod kątem rozproszenia światła w przód (forward scatter) względem rozproszenia bocznego (side scatter). Bramka dla żywych komórek jest tworzona na podstawie rozproszenia w przód, które mierzy wielkość komórki, oraz rozproszenia bocznego, które mierzy złożoność lub ziarnistość komórki.</li>
			<li>Komórki mieszczące się w tej bramce są następnie badane pod kątem barwienia PE. Bramka dla PE-ujemnych jest ustawiana dla niebarwionych komórek transfekowanych lub barwionych komórek gospodarza. Podczas analizy barwionych komórek transfekowanych metodą FACS wyznacza się bramkę „High PE”, aby objęła górne 5% wszystkich komórek wykazujących pozytywne barwienie PE.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Inkubuj płytki w inkubatorze w temperaturze 37°C przez dwa tygodnie.</li>
</ol>
3. Dokumentacja tworzenia kolonii za pomocą urządzenia CloneSelect Imager
Dokumentuj powstawanie kolonii w płytkach 96-dołkowych za pomocą systemu CloneSelect Imager w dniu 0, 3, 7 i 13 po sortowaniu FACS. Dokumentacja obrazowa zapewni wybór klonów pochodzących z pojedynczej komórki. Krytycznym krokiem w tej dokumentacji jest prawidłowe ustawienie płaszczyzny ogniskowania dla pomiaru w dniu 0, ponieważ w tym czasie w każdym dołku znajduje się tylko jedna komórka. Bardzo ważne jest, aby obrazy tych pojedynczych komórek były ostre; próby regulacji ostrości bezpośrednio na nich mogą być w najlepszym razie mylące. Płaszczyzna ogniskowania może się znacząco różnić w zależności od marki płytek, a nawet między partiami tej samej marki. W związku z tym należy zastosować wcześniej określoną płaszczyznę ogniskowania. Można to osiągnąć poprzez ustawienie ostrości na mikrokulki testowe lub komórki o wysokiej gęstości naniesione na płytki z tej samej partii, która jest używana. Alternatywnie, do tego celu można wykorzystać całkowicie przerostłe płytki z tej samej partii. Po sortowaniu FACS ważne jest również pozostawienie komórek na minimum 2 godziny przed obrazowaniem, aby „ustabilizowały się” one w pozycji na płytce.
4. Przesiewanie i wybór wysokowydajnych klonów
<ol>
	<li>Zadokumentuj pozycję próbek na odbiorczych 96-dołkowych płytkach analitycznych.</li>
	<li>Przenieś aliquoty 20 μl supernatantu (rozcieńczając w razie potrzeby) na 96-dołkowe płytki analityczne za pomocą systemu do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO. Ta elastyczna i wydajna platforma robotyczna została przystosowana do tej oraz innych zautomatyzowanych prac nad kulturami komórkowymi. Stworzono specjalne programy, aby jak najlepiej wykorzystać i rozszerzyć możliwości robota Freedom EVO w procesie opracowywania linii komórkowych. Przykładem jest ustawienie systemu TECAN tak, aby interpretował dane z obrazowania CloneSelect Imager w celu pobierania próbek z dołków zawierających pojedyncze kolonie. Wymagane były inne programy do wykonywania dodatkowych zadań związanych z kulturą komórek, takich jak przygotowanie odpowiednich rozcieńczeń pobranych próbek, interpretacja, katalogowanie i pobieranie próbek z płytek oznakowanych ręcznie, jeśli było to wymagane, a także skalowanie klonów o wysokiej wydajności itp. Wiele z tych programów można łatwo zastosować zarówno do płytek 384-dołkowych, jak i do oryginalnego formatu 96-dołkowego.</li>
	<li>Produkcję przeciwciał w próbkach analizuje się za pomocą kanapkowego testu ELISA do wykrywania ludzkiego IgG (Pierce, Rockford, IL) w systemie do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO.
		<ol>
			<li>Próbki oraz standard (Human myeloma IgG1, kappa) (Sigma, St. Louis, MO) naniesiono na wcześniej powlekane płytki Bio Coat Anti-Human IgG Assay Plates (BD Biosciences, San Jose, CA).</li>
			<li>Płytki inkubowano w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, a następnie trzykrotnie przemyto buforem PBS.</li>
			<li>Do płytki dodano ImmunoPure Goat Anti-Human IgG, (Fc-gamma)-HRP (Pierce, Rockford, IL) w rozcieńczeniu 1:2000 i inkubowano przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Płytki przemyto trzykrotnie buforem PBS przed dodaniem substratu ABTS (Pierce, Rockford, IL), a następnie odczytano je w czytniku płytek, mierząc absorbancję przy 405 nm w celu detekcji.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Wybierz wysoko wydajne klony i oceń ich produktywność w hodowli zawiesinowej. W przypadku hodowli typu fed-batch komórki szczepiono w stężeniu 0.3X106 cells/mL w medium wolnym od białek JRH ImMEDIAte ADVANTAGE 65578 (SAFC Biosciences, Lenexa, KS) uzupełnionym o 5 g/L hydrolizatu soi (DMV International, numer katalogowy SE50MAF-UF, numer partii ) i inkubowano w 37°C przy 7.5% CO2. Hodowlę kontynuowano, uzupełniając o 2 g/L glukozy (Sigma, numer katalogowy G8769, numer partii 098K2329), gdy stężenie glukozy i mleczanu w kulturze spadło poniżej 2 g/L, oraz dodając 2 mM glutaminy (Gibco, numer katalogowy 25030, numer partii 568177), gdy poziom glutaminy spadł poniżej 200 mg/L (metabolity mierzone za pomocą Bioanalizatora YSI). Hodowle fed-batch zakończono w 14. dniu, a produkcję przeciwciał zmierzono metodą HPLC w fazie odwróconej.</li>
	<li>Charakterystyka genetyczna klonów kandydujących za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH)5.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Przykład opracowywania klonów produkujących przeciwciała przy użyciu metody wysokoprzepustowej przedstawiono na Rysunku 1 i Rysunku 2. Pula przetransfekowanych komórek została zabarwiona fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem anty-human IgG (Rysunek 1A), a następnie przeanalizowana i posortowana na urządzeniu BD FACSAria (Rysunek 1B). Tworzenie kolonii na płytce 96-dołkowej obrazowano za pomocą CloneSelect Imager (Rysunek 1C). Nadpłyn z hodowli komórkowej pobierano z dołków zawierających pojedyncze kolonie i analizowano metodą ELISA na systemie do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO (Rysunek 1D). Wysoce produktywne klony zidentyfikowano wśród komórek wykazujących wyższy poziom przeciwciał powierzchniowych, co odzwierciedlało barwienie fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem anty-human IgG. Porównując klony wygenerowane z dwóch populacji początkowej puli przetransfekowanych komórek, zaobserwowano ogromną różnicę w produktywności w hodowli typu fed-batch (Rysunek 2). Dla dwóch najlepszych klonów wygenerowanych z populacji komórek o wysokiej ekspresji przeciwciał powierzchniowych (PE high) produktywność specyficzna wynosiła od 50-70 pg/cell/day. Natomiast produktywność przeciwciał wynosiła ~20 pg/cell/day dla dwóch najlepszych klonów wygenerowanych z populacji komórek o niskiej ekspresji przeciwciał powierzchniowych (PE low). Ponadto linie komórkowe opracowane za pomocą sortowania FACS są bardziej stabilne pod względem produkcji przeciwciał niż te, które zostały sklonowane poprzez ręczne rozcieńczanie limitujące (Rysunek 3A). Produktywność specyficzna najlepszego klonu, „Clone 1”, wygenerowanego przez ręczne rozcieńczanie limitujące, spadła z ~30 pcd do ~10 pcd po hodowli przez 80 podwojeń komórek. Z drugiej strony, najlepszy subklon wygenerowany przez sortowanie FACS, „Clone 2”, był w stanie utrzymać produktywność specyficzną na poziomie około 20 pcd przez co najmniej 100 podwojeń komórek. Za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) wykazaliśmy, że Clone 1 stanowił mieszaną populację fenotypu A (85%) i fenotypu B (15%). W przeciwieństwie do tego, klon sortowany przez FACS (clone 2) okazał się populacją bardziej jednorodną, w której 99,5% komórek okazało się być fenotypem A (Rysunek 3B).
<img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig1.jpg" alt="Analiza wzrostu komórek; mikroskopia fluorescencyjna, cytometria przepływowa, tworzenie kolonii, wykres miana przeciwciał." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Opracowanie linii komórkowych do produkcji przeciwciał monoklonalnych z komórek CHO. A) Barwienie powierzchniowe początkowej puli przetransfekowanych komórek przy użyciu przeciwciała anty-IgG ludzkiego znakowanego fluorescencyjnie. B) Sortowanie populacji komórek o wysokiej intensywności fluorescencji (PE high) i niskiej intensywności fluorescencji (PE low) do płytki 96-dołkowej. C) Dokumentowanie tworzenia kolonii od dnia 0 do dnia 13 po wysianiu przy użyciu systemu CloneSelect Imager. D) Przesiew klonów metodą ELISA. 
<img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig2.jpg" alt="Wykres miana objętościowego w funkcji specyficznej produktywności; porównanie danych dla wysokiej i niskiej ekspresji białka." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Poziom przeciwciał związanych z powierzchnią koreluje z produktywnością przeciwciał komórki. Klony o wysokim i niskim stopniu barwienia fluorescencyjnego zostały przekształcone w linie komórkowe i ocenione w hodowli typu fed-batch. Miano objętościowe oraz specyficzna produktywność zostały porównane dla dwóch najlepszych klonów z każdej populacji.
<img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig3.jpg" alt="Wykres wydajności komórek i obraz fluorescencji chromosomów; porównanie fenotypów starzenia się klonów za pomocą FACS i rozcieńczeń." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Klony wygenerowane poprzez sortowanie FACS wykazują wyższą homogeniczność genetyczną i stabilność klonalną. A) Stabilność produkcji przeciwciał w hodowli okresowej przez około 80 podwojeń komórek w czasie trwania hodowli. Δ, klon został wygenerowany metodą rozcieńczeń ograniczających, gdzie komórki zasiano w gęstości 2000 komórek/dołek, 1000 komórek/dołek oraz 500 komórek/dołek. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010triangle.jpg" alt="Równowaga statyczna; ΣFx=0; schemat stabilności mechanicznej; edukacyjny koncept z fizyki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Czarny Trójkąt">, klon został wygenerowany metodą FACS w gęstości 1 komórki/dołek. B) Miejsce integracji transgenu w chromosomie komórki CHO zidentyfikowane za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ.

<ol><li>Hung, F., Deng, L., Ravnikar, P., Condon, R., Li, B., Do, L., Saha, D., Tsao, Y. S., Merchant, A., Liu, Z., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+stability+and+antibody+production+in+CHO+cells%3A+improvement+through+gene+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">mRNA stability and antibody production in CHO cells: improvement through gene optimization.</a> Biotechnol. J. 5, 393-401 (2010).</li>
<li>Brezinsky, S. C., Chiang, G. G., Szilvasi, A., Mohan, S., Shapiro, R. I., MacLean, A., Sisk, W., Thill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+enriching+populations+of+transfected+CHO+cells+for+cells+of+higher+specific+productivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specific productivity.</a> J. Immunol. Methods. 277, 141-155 (2003).</li>
<li>Kromenaker, S. J., Srienc, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+producer+hybridoma+cell+lines+after+cell+sorting%3A+a+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Stability of producer hybridoma cell lines after cell sorting: a case study.</a> Biotechnol. Prog. 10, 299-307 (1994).</li>
<li>Marder, P., Maciak, R. S., Fouts, R. L., Baker, R. S., Starling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+cloning+of+hybridoma+cells+for+enhanced+immunoglobulin+production+using+flow+cytometric+cell+sorting+and+automated+laser+nephelometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Selective cloning of hybridoma cells for enhanced immunoglobulin production using flow cytometric cell sorting and automated laser nephelometry.</a> Cytometry. 11, 498-505 (1990).</li>
<li>Henegariu, O., Heerema, N., Wright, L. L., Bray-Ward, P., Ward, D. C., Vance, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+in+cytogenetic+slide+preparation%3A+controlled+chromosome+spreading+chemical+aging+and+gradual+denaturing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytomery%22%5BJournal%5D)">Improvements in cytogenetic slide preparation: controlled chromosome spreading chemical aging and gradual denaturing.</a> Cytomery. 43, 101-109 (2001).</li>
<li>Meng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grenn+fluorescent+protein+%28GFP%29+as+a+second+selectable+marker+for+selection+of+high+producing+clones+from+transfected+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Grenn fluorescent protein (GFP) as a second selectable marker for selection of high producing clones from transfected CHO cells.</a> Gene. 242, 201-207 (2000).</li>
<li>DeMaria, C. T., Cairns, V., Schwarz, C., Zhang, J., Guerin, M., Zuena, E., Estes, S., Karey, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+clone+selection+for+recombinant+CHO+cells+using+a+FACS-based+high-throughput+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Accelerated clone selection for recombinant CHO cells using a FACS-based high-throughput screen.</a> Biotechnol. Prog. 23, 465-472 (2007).</li>
<li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+microdrop+technology+for+rapid+isolation+of+rare+an+high+producer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Gel microdrop technology for rapid isolation of rare an high producer cells.</a> Nat. Med. 3, 583-585 (1997).</li>
</ol>

Autorzy tego artykułu są pracownikami firmy Merck &amp; Co., Inc., która wykorzystuje tę metodę do wielkoskalowej produkcji terapeutyków białkowych z linii komórkowych ssaków.

Przedstawiliśmy zautomatyzowaną platformę do opracowywania linii komórkowych do produkcji, która umożliwia izolację wysoko wydajnych klonów, zapewniając jednocześnie klonalność i stabilność klonu. Zastosowanie barwienia przeciwciał powierzchniowych z następującym po nim sortowaniem komórek metodą FACSAria jest kluczowe dla uzyskania pojedynczych klonów o wysokiej wydajności produkcji przeciwciał. Nasze wyniki oraz inne doniesienia2-4 sugerują, że poziom przeciwciał przejściowo eksponowanych na powierzchni komórki dobrze koreluje z wydajnością komórki. Zatem przeciwciało sprzężone z fluoresceiną może zostać użyte do rozpoznania produktu związanego z błoną i wspomagania izolacji wysoko wydajnych producentów. Alternatywnie, w celu ułatwienia selekcji wysoko wydajnych klonów za pomocą FACS stosowano koekspresję genów reporterowych oraz technologię mikrokropel żelowych6-8. Oprócz izolacji wysoko wydajnych klonów za pomocą FACS, opracowano inne technologie służące do osiągnięcia tego samego celu. Należą do nich technologia CellSpot firmy Trellis Bioscience, która wykorzystuje systemy detekcji przeciwciał za pomocą mikrosfer oraz technologię skanowania laserowego do identyfikacji wysoko wydajnych klonów i eliminacji niepożądanych komórek, a także platformy Genetix ClonePix FL oraz StemCell Technologies ClonaCell EasyPick, które umożliwiają wysokoprzepustowe skanowanie produkcyjnych linii komórkowych przy użyciu fluorescencyjnego systemu detekcji przeciwciał. Zdecydowaliśmy się na wdrożenie metody klonowania FACS w oparciu o poziom przeciwciał związanych z powierzchnią, ponieważ łączy ona łatwość obsługi, selektywność ze względu na wydajność oraz klonalność.
Zastosowanie systemu do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO znacząco zwiększyło przepustowość screeningu, co umożliwiło wyselekcjonowanie klonów o wysokiej wydajności z znacznie większej puli komórek. Inna aparatura analityczna, taka jak HTRF, BioForte Octet, HPLC itp., stanowi również możliwe sposoby selekcji wysokowydajnych producentów i odrzucania tych o niskiej wydajności. Dzięki śledzeniu formowania się klonów za pomocą CloneSelect Imager wygenerowano niezbędną dokumentację potwierdzającą klonalność wraz z cyfrową historią linii komórkowej. Klonalność jest dodatkowo potwierdzana poprzez genetyczną charakterystykę pojedynczego miejsca integracji transgenu w chromosomie. W związku z tym można pominąć etap subklonowania, który zazwyczaj wykonuje się w celu zapewnienia klonalności. Pozwala to zaoszczędzić od 4 do 8 tygodni czasu w procesie opracowywania linii komórkowej. Podsumowując, wysokiej jakości linie komórkowe wygenerowane za pomocą zautomatyzowanej platformy wysokoprzepustowej wykazały wysoką produktywność, stabilność produkcji oraz udokumentowaną historię linii komórkowej, co powinno spełniać wymagania produkcji na dużą skalę oraz aktualne wymogi regulacyjne.

<table><tbody><tr><td>Sorter komórek BD FACS Aria&amp;#8482;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obrazownik CloneSelect&amp;#8482;</td><td>Genetix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO&amp;#174;</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa zautomatyzowana platforma do opracowywania linii komórkowych produkcyjnych dla białkowych produktów terapeutycznych

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

Szybko rozwijający się przemysł biofarmaceutyczny wymaga sprawnego opracowywania wysoce wydajnych i niezawodnych systemów produkcyjnych, aby sprostać rosnącemu zapotrzebowaniu na dostawy leków. Tworzenie produkcyjnych linii komórkowych tradycyjnie opierało się na operacjach manualnych, które są pracochłonne, charakteryzują się niską przepustowością i są podatne na błędy ludzkie. Przedstawiamy w niniejszym opracowaniu zintegrowaną, zautomatyzowaną platformę wysokoprzepustową do opracowywania linii komórkowych przeznaczonych do produkcji białkowych terapeutyków.
Połączenie sortera komórek BD FACS Aria, systemu obrazowania CloneSelect Imager oraz systemu do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO umożliwiło stworzenie wysokoprzepustowego i bardziej efektywnego procesu rozwoju linii komórkowych. W tej procedurze komórki gospodarza produkcyjnego są najpierw transfekowane wektorem ekspresyjnym niosącym interesujący gen 1, a następnie poddawane działaniu czynnika selekcyjnego. Komórki stabilnie transfekowane są następnie barwione przeciwciałem anty-IgG przeciwko ludzkim białkom znakowanym fluorescencyjnie, a następnie poddawane analizie cytometrycznej 2-4. Wysoce produktywne komórki są wybierane na podstawie intensywności fluorescencji i izolowane poprzez sortowanie pojedynczych komórek za pomocą BD FACSAria. Tworzenie kolonii z etapu pojedynczej komórki było wykrywane mikroskopowo, a system CloneSelect Imager rejestrował serię cyfrowych obrazów time-lapse w celu dokumentacji historii linii komórkowej. Po utworzeniu się pojedynczych klonów, były one przesiewane pod kątem produktywności za pomocą testu ELISA wykonanego na systemie do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO. Przy obecnej konfiguracji systemu w jednym cyklu operacyjnym można przesiać od około 2 000 do 10 000 klonów.
To zintegrowane podejście zostało wykorzystane do generowania wysokowydajnych linii komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) do produkcji terapeutycznych przeciwciał monoklonalnych (mAb), a także ich białek fuzyjnych. Dzięki zastosowaniu różnych rodzajów sond detekcyjnych, metodę tę można wykorzystać do opracowywania innych białek terapeutycznych lub zastosować w innych systemach gospodarzy produkcyjnych. W porównaniu z tradycyjną procedurą ręczną, ta zautomatyzowana platforma wykazała zalety w postaci znacznie zwiększonej przepustowości, zapewnionej klonalności, możliwości prześledzenia historii linii komórkowej dzięki dokumentacji elektronicznej oraz znacznie mniejszego ryzyka błędów operatora.

Opisano wysokoprzepustową, zautomatyzowaną platformę rozwoju linii komórkowych do produkcji białkowych leków terapeutycznych. Wdrożenie sortera komórek BD FACS Aria, obrazownika CloneSelect Imager oraz systemu do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO wykazało znaczące zwiększenie wydajności przetwarzania w procesie rozwoju linii komórkowych, przy jednoczesnej poprawie jakości linii komórkowych i wysokiej powtarzalności.

Wysokoprzepustowa zautomatyzowana platforma do opracowywania linii komórkowych produkcyjnych dla białkowych produktów terapeutycznych

Szybko rozwijający się przemysł biofarmaceutyczny wymaga sprawnego opracowywania wysoce wydajnych i niezawodnych systemów produkcyjnych, aby sprostać rosnącym...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie linii komórkowych do produkcji leków biologicznych, charakteryzujących się klonalnością oraz wysoką wydajnością. Osiąga się to najpierw poprzez transfekcję komórki gospodarza DNA kodującym gen zainteresowania. Kolejnym krokiem procedury jest izolacja wysokowydajnych klonów za pomocą FACS, a następnie dokumentacja tworzenia kolonii przy użyciu systemu CloneSelect Imager.Ostatnim krokiem jest przesiewanie i wybór wysoko wydajnych klonów. Ostatecznie, za pomocą HPLC w fazie odwróconej, można uzyskać wyniki wykazujące produkcję przeciwciał w hodowlach ciągłych i fed-batch. Prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy sortowania i pcan 80 dgl są trudne do opanowania ze względu na złożoność konfiguracji wymaganej w tych procedurach. Następujący naukowcy z laboratorium zaprezentują te procedury: Jason Sanders zademonstruje transfekcję komórek gospodarza oraz sortowanie w celu dokumentacji tworzenia kolonii, a Russell Kan pobieranie próbek za pomocą systemu Tecan.Aby rozpocząć tę procedurę, jeden dzień przed transfekcją wysiać komórki gospodarza do kolby hodowlanej w 15 mililitrach pożywki wzrostowej. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 7,5% dwutlenku węgla. Następnego dnia przygotować kompleksy transfekcyjne: najpierw rozpuścić 8 µg DNA w 800 µl pożywki wzrostowej bez surowicy w sterylnej probówce do mikrocentryfugi i delikatnie wymieszać. Następnie rozcieńczyć 40 µl lipofektaminy w 800 µl pożywki wzrostowej bez surowicy w probówce polistyrenowej.Dodaj rozcieńczone DNA do rozcieńczonej Lipofectaminy. Wymieszaj delikatnie i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby przygotować komórki gospodarza do transfekcji. Usuń pożywkę wzrostową z komórek i zastąp ją 6,4 milliliters pożywki wzrostowej bez surowicy.Do kolby dodać 1,6 milliliters kompleksów transfekcyjnych. Wymieszać delikatnie, kołysząc kolbą. Inkubować komórki w temperaturze 37 degrees Celsius w inkubatorze z dwutlenkiem węgla przez sześć godzin.Po sześciu godzinach do kolby należy dodać osiem mililitrów pożywki wzrostowej i inkubować w inkubatorze z dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 °C przez noc. Następnego dnia pożywkę należy usunąć poprzez aspirację i dodać do kolby świeżą pożywkę wzrostową. Po tej inkubacji komórki należy ponownie inkubować przez noc.Zastąp pożywkę wzrostową pożywką selekcyjną. Inkubuj komórki w temperaturze 37°C w inkubatorze z dwutlenkiem węgla przez dwa do trzech tygodni. Dwa do trzech tygodni po transfekcji komórki są gotowe do klonowania za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Oddziel komórki z kolby i wiruj przy 800 RPM przez pięć minut w temperaturze 4°C.Resuspenduj komórki w medium selekcyjnym uzupełnionym o 2% bovine serum albumin. Następnie dodaj przeciwciało anty-human IgG znakowane fluorescencyjnie. Dodaj rozcieńczenie w stosunku 1:20, inkubuj na lodzie od 15 do 30 minut, a następnie przemyj dwukrotnie zimnym PBS i resuspenduj komórki w 1 XPBS w probówce polipropylenowej.Przykład zabarwionych komórek przedstawiono na tym zdjęciu; w celu przeprowadzenia aseptycznej sortowania na urządzeniu BD FACS Aria, należy przygotować 96-dołkową płytkę do hodowli komórek zawierającą 200 µL medium selekcyjnego w każdym dołku. Aseptycznie załadować probówkę z komórkami i przeanalizować je na urządzeniu BD FACS Aria, a następnie zapisać wyniki odpowiednio dla komórek zabarwionych i niezabarwionych.Ustaw bramki i parametry w celu posortowania pojedynczych komórek o pożądanym profilu barwienia fluorescencyjnego do płytki 96-dołkowej. Inkubuj płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez dwa tygodnie. W dniu 0, 3, 7 i 13 po sortowaniu udokumentuj tworzenie kolonii w płytce 96-dołkowej za pomocą obrazownika do selekcji klonów, aby zapewnić wybór klonów pochodzących z pojedynczej komórki w celu przesiewania i selekcji klonów o wysokiej produktywności. Najpierw udokumentuj pozycję próbki w odbiorczej 96-dołkowej płytce analitycznej. Następnie użyj zrobotyzowanego systemu do obsługi cieczy, aby przenieść alikwoty 20 µL supernatantu do każdego dołka 96-dołkowej płytki analitycznej. Produkcję przeciwciał w próbkach analizuje się za pomocą testu kanapkowego.Wykrywanie ludzkiego IgG metodą ELI SA za pomocą systemu do manipulacji cieczami w następujący sposób. Najpierw próbki i wzorzec nanosi się na wcześniej zakodowane płytki do analizy bio coat przeciwko ludzkiemu IgG. Płytki inkubuje się w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, a następnie wykonuje trzy płukania w PBS.Następnie do płytek dodaje się przeciwciała kozie anty-ludzkie IgG z koniugatem HRP w rozcieńczeniu 1:2000 i inkubuje je przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po godzinie płytki przemywa się trzykrotnie PBS, a następnie dodaje substrat TMB.Na koniec płytki odczytuje się za pomocą czytnika płytek, wykorzystując absorbancję przy 405 nanometrach do detekcji. Dzięki zastosowaniu tej zautomatyzowanej platformy stwierdzono, że poziom przeciwciał powierzchniowych, określony poprzez barwienie przeciwciałami anty-ludzkimi IgG znakowanymi fluorescencyjnie, koreluje z produktywnością przeciwciał komórki. Jak pokazano tutaj dla dwóch najlepszych klonów wygenerowanych z populacji komórek o wysokiej ekspresji przeciwciał powierzchniowych, produktywność specyficzna wynosiła od 50 do 70 picogramów na komórkę na dzień.W przeciwieństwie do tego, produktywność przeciwciał wynosiła około 20 picogramów na komórkę na dzień dla dwóch najlepszych klonów uzyskanych z populacji komórek o niskiej ekspresji przeciwciał powierzchniowych. Ponadto linie komórkowe opracowane metodą sortowania FACS są bardziej stabilne pod względem produkcji przeciwciał niż te, które zostały wyklonowane poprzez manualne rozcieńczanie ograniczające. Specyficzna produktywność najlepszego klonu (klon jeden) uzyskanego poprzez manualne rozcieńczanie ograniczające spadła z około 30 PCD do około 10 PCD po hodowli przez 80 podwojeń komórek.Z drugiej strony, najlepszy subklon uzyskany poprzez sortowanie FACS z klonu dwa był w stanie utrzymać wydajność specyficzną na poziomie około 20 PCD przez co najmniej 100 podwojeń komórek. Identyfikacja miejsca integracji transgenu w chromosomie komórkowym za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ wykazała, że klon jeden jest mieszaną populacją fenotypu A i fenotypu B. W przeciwieństwie do niego, klon sortowany metodą FACS okazał się populacją bardziej jednorodną, w której 99,5% komórek miało fenotyp A. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat opracowywania linii komórkowych do produkcji białek terapeutycznych.

a-high-throughput-automated-platform-for-development-manufacturing

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Wysokowydajna zautomatyzowana platforma do opracowywania linii komórkowych produkcyjnych dla terapii białkami

Przedstawiamy podejście mikrofluidyczne do ekspresji macierzy białkowych. Urządzenie składa się z tysięcy komór reakcyjnych sterowanych za pomocą mikromechanicznych zaworów. Urządzenie mikrofluidyczne jest połączone z biblioteką genów naniesioną w formie mikromacierzy. Geny te są następnie transkrybowane i translacyjne bezpośrednio na chipie, co pozwala na otrzymanie macierzy białkowej gotowej do zastosowań eksperymentalnych.

Generator wysokoprzepustowej ekspresji białek z wykorzystaniem platformy mikroprzepływowej

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

Opisane protokoły pozwalają laboratoriom na przeprowadzanie skalowalnych, przylegających hodowli komórek macierzystych z dużą wydajnością przy minimalnym nakładzie pracy, doświadczenia i inwestycji w sprzęt przy użyciu programowalnego robota do obsługi cieczy i 96-dołkowych płytek.  iPSC pasażowane ponad 20 razy w tym systemie utrzymywały pluripotencję, prawidłowe kariotypy i różnicowały się w kardiomiocyty.

Skalowalna hodowla i produkcja iPSC na 96-dołkowych płytkach przy użyciu zrobotyzowanego systemu obsługi cieczy

Przedstawiono szczegółowy protokół jednoczesnego działania 48 równoległych kultur komórkowych w różnych warunkach w systemie mikrobioreaktora. Opisano proces hodowli komórek, zbiór i późniejszą analizę miana przeciwciał.

Zastosowanie wysokowydajnego zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktorów do produkcji modelowej IgG1 w komórkach CHO

Automatyzacja jest kluczem do skalowania i zarządzania kosztami w produkcji ogniw. Niniejszy manuskrypt opisuje zastosowanie przeciwprądowego urządzenia do odśrodkowego przetwarzania komórek do automatyzacji etapów wymiany i koncentracji komórek w bioprzetwarzaniu na małą skalę.

Zautomatyzowany przeciwprądowy system odśrodkowy do przetwarzania komórek na małą skalę

Pokazujemy automatyzację indukowanych przez człowieka hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) i różnicowanie neuronów zgodne z automatycznym obrazowaniem i analizą.

Zautomatyzowana produkcja indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów korowych i dopaminergicznych pochodzących z komórek macierzystych ze zintegrowanym monitorowaniem żywych komórek

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający produkcję na dużą skalę komórek przylegających za pomocą całkowicie zamkniętego systemu opartego na rozpuszczalnych mikronośnikach klasy GMP. Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, komórek HEK293T i komórek Vero została zwalidowana i spełniła zarówno wymagania ilościowe, jak i kryteria jakościowe dla branży terapii komórkowej i genowej.

Produkcja ogniw na dużą skalę w oparciu o rozpuszczalne porowate mikronośniki klasy GMP

Ten artykuł szczegółowo opisuje proces produkcji limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym do użytku klinicznego, w szczególności przy użyciu automatycznego procesora komórkowego zdolnego do przeprowadzania transdukcji wirusa i hodowli limfocytów T. Przedstawiamy rekomendacje i opisujemy pułapki, które należy wziąć pod uwagę podczas opracowywania procesu i wdrażania badania klinicznego wczesnej fazy.

Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym na zautomatyzowanym procesorze komórkowym

Protokół ten dokumentuje wytwarzanie i montaż SPOT, wysokoprzepustowej platformy hodowlanej opartej na rusztowaniach, w formatach 96- i 384-dołkowych. Szczegółowo opisuje również proces wysiewu dla SPOT, zarówno ręczny, jak i przy użyciu dostępnego na rynku urządzenia do obsługi cieczy.

Powtarzalna produkcja SPOT jako wysokoprzepustowej platformy hodowlanej opartej na rusztowaniach

Protokół ten opisuje skalowalną metodę rozszerzania produktów Adoptive Cell Therapies (ACT), mianowicie komórek Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T oraz komórek zabójczych indukowanych cytokinami (CIK), wykorzystujących urządzenia Gas-permeable Rapid Expansion (G-Rex), wykazując efektywny i solidny wzrost w klinicznie istotnych warunkach.

Efektywna i szybka generacja komórek zabójczych indukowanych przez CAR-T i cytokiny w urządzeniach skalowalnych GMP

Poznaj zautomatyzowaną platformę do rozwoju linii komórkowych do produkcji leków białkowych. Wykorzystuje cytometrię przepływową i obrazowanie kolonii, zapewniając wysoką produktywność i stabilność klonów.

Wysokoprzepustowa zautomatyzowana platforma do opracowywania linii komórkowych produkcyjnych dla białkowych produktów terapeutycznych

Przeglądaj więcej filmów