Wysokoprzepustowa zautomatyzowana platforma do opracowywania linii komórkowych produkcyjnych dla białkowych produktów terapeutycznych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie linii komórkowych do produkcji leków biologicznych, charakteryzujących się klonalnością i wysoką wydajnością. Osiąga się to poprzez przeprowadzenie transfekcji komórki gospodarza DNA kodującym gen zainteresowania. Kolejnym krokiem procedury jest izolacja wysokowydajnych klonów przy użyciu systemu FACS, a następnie dokumentacja tworzenia kolonii za pomocą obrazowania CloneSelect.

Ostatnim etapem jest przesiewanie i wybór wysoko wydajnych klonów. W końcowym rozrachunku, za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w fazie odwróconej (reverse phase HPLC), można uzyskać wyniki wykazujące produkcję przeciwciał w kulturach ciągłych i okresowo zasilanych (fed-batch). Demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy sortowania i pcan 80 dgl są trudne do opanowania ze względu na złożoną konfigurację aparatury wymaganą w tych procedurach; poniżsi naukowcy z laboratorium zaprezentują te procedury: Jason Sanders zademonstruje transfekcję komórek gospodarza oraz sortowanie w celu dokumentacji tworzenia kolonii, a Russell Kan pobieranie próbek za pomocą systemu tecan.

Aby rozpocząć tę procedurę, na dzień przed transfekcją wysiać komórki gospodarza do kolby hodowlanej w 15 mililitrów medium wzrostowego. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 7,5% CO2. Następnego dnia przygotować kompleksy transfekcyjne: najpierw rozpuścić 8 µg DNA w 800 µl medium wzrostowego bez serum w sterylnej probówce do wirówki, mieszając delikatnie. Następnie rozcieńczyć 40 µl lipofektaminy w 800 µl medium wzrostowego bez serum w probówce polistyrenowej.

Dodaj rozcieńczone DNA do rozcieńczonej Lipofectaminy. Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby przygotować komórki gospodarza do transfekcji. Usuń z komórek pożywkę wzrostową i zastąp ją 6,4 milliliters pożywki wzrostowej bez surowicy.

Dodaj 1,6 ml kompleksów transfekcyjnych do kolby. Wymieszaj delikatnie, kołysząc kolbą. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z dwutlenkiem węgla przez sześć godzin.

Po sześciu godzinach do kolby należy dodać osiem mililitrów pożywki wzrostowej i inkubować w inkubatorze z dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 °C przez noc w następnym dniu. Pożywkę należy usunąć poprzez aspirację i dodać do kolby świeżą pożywkę wzrostową. Po tej inkubacji nocnej komórki należy ponownie inkubować przez noc.

Zastąp pożywkę wzrostową pożywką selekcyjną. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z dwutlenkiem węgla przez dwa do trzech tygodni. Dwa do trzech tygodni po transfekcji komórki są gotowe do klonowania za pomocą sortowania komórek aktywowanego cytometrią przepływową; oddziel komórki od kolby i odwiruj przy 800 RPM przez pięć minut w temperaturze 4 °C.

Resuspendować komórki w medium selekcyjnym uzupełnionym o 2% albuminy surowicy bydlęcej. Następnie dodać znakowane fluorescencyjnie przeciwciało anty-human IgG. Dodać rozcieńczenie 1:20, inkubować w lodzie od 15 do 30 minut, a następnie dwukrotnie przemyć zimnym PBS i resuspendować komórki w 1 XPBS w probówce polipropylenowej.

Na tym zdjęciu przedstawiono przykład zabarwionych komórek do aseptycznego sortowania na BD FACS Aria. Należy przygotować 96-dołkową płytkę do hodowli komórkowych, zawierającą 200 µL medium selekcyjnego w każdym dołku. W sposób aseptyczny należy załadować probówkę z komórkami i przeanalizować je na BD FACS Aria, a następnie zapisać wyniki odpowiednio dla komórek zabarwionych i niezabarwionych.

Ustaw bramki i parametry w celu sortowania pojedynczych komórek o pożądanym profilu barwienia fluorescencyjnego do płytki 96-dołkowej; inkubuj płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez dwa tygodnie. W dniu 0., 3., 7. i 13. po sortowaniu udokumentuj tworzenie kolonii w płytce 96-dołkowej za pomocą obrazownika do selekcji klonów, aby zapewnić wybór klonów pochodzących z pojedynczej komórki w celu przesiewania i wyselekcjonowania klonów o wysokiej produktywności. Najpierw udokumentuj położenie próbek w odbiorczej 96-dołkowej płytce analitycznej. Następnie użyj zrobotyzowanego systemu do obsługi cieczy, aby przenieść aliquoty 20 µL supernatantu do każdego dołka 96-dołkowej płytki analitycznej; produkcję przeciwciał w próbkach analizuje się metodą kanapkową.

Wykrywanie ludzkiego IgG metodą ELI SA na systemie do obsługi cieczy w następujący sposób. Najpierw próbki oraz standard naniesiono na wcześniej zakodowane płytki testowe z powłoką bio coat przeciwciał przeciwko ludzkiemu IgG. Płytki inkubowano w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, a następnie wykonano trzy przemycia buforem PBS.

Następnie do płytek dodaje się przeciwciało IgG przeciwko ludzkim przeciwciałom z kozy (immuno pure goat anti-human IgG) sprzężone z HRP w rozcieńczeniu 1:2000 i inkubuje się je przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po godzinie płytki płucze się trzykrotnie PBS, a następnie dodaje substrat A BTS.

Na koniec płytki są odczytywane za pomocą czytnika płytek, wykorzystując absorbancję przy 405 nanometrach do detekcji. Dzięki zastosowaniu tej zautomatyzowanej platformy stwierdzono, że poziom przeciwciał powierzchniowych, odzwierciedlony przez barwienie z użyciem przeciwciał anty-IgG przeciwko człowiekowi znakowanych fluorescencyjnie, koreluje z produktywnością przeciwciał komórki. Jak pokazano tutaj dla dwóch najlepszych klonów wygenerowanych z populacji komórek o wysokiej ekspresji przeciwciał powierzchniowych, specyficzna produktywność wynosiła od 50 do 70 pikogramów na komórkę na dobę.

W przeciwieństwie do tego, produktywność przeciwciał wynosiła około 20 picogramów na komórkę na dzień dla dwóch najlepszych klonów wygenerowanych z populacji komórek o niskiej ekspresji przeciwciał powierzchniowych. Ponadto linie komórkowe opracowane metodą FACS są bardziej stabilne pod względem produkcji przeciwciał niż te, które zostały sklonowane poprzez manualne rozcieńczanie ograniczające. Produktywność specyficzna najlepszego klonu (klon jeden) wygenerowanego metodą manualnego rozcieńczania ograniczającego spadła z około 30 PCD do około 10 PCD po hodowli przez 80 podwojeń komórek.

Z drugiej strony, najlepszy subklon uzyskany poprzez sortowanie FACS z klonu drugiego był w stanie utrzymać specyficzną produktywność na poziomie około 20 PCD przez co najmniej 100 podwojeń komórek. Identyfikacja miejsca integracji transgenu w chromosomie komórkowym za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ wykazała, że klon pierwszy stanowi mieszaną populację fenotypu A i fenotypu B. W przeciwieństwie do niego, klon sortowany FACS wydawał się być bardziej jednorodną populacją, w której 99,5% komórek posiadało fenotyp A. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak opracowywać produkcyjne linie komórkowe do wytwarzania białek terapeutycznych.