Ekstrakcja egzosomów na bazie kulek magnetycznych: technika izolowania określonych egzosomów z biopłynów

Egzosomy to zewnątrzkomórkowe struktury pęcherzykowe wydzielane przez komórki do płynów biologicznych. Aby wychwycić określone egzosomy z płynów biologicznych, zacznij od umieszczenia w probówce kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną.

Do tej probówki dodaj biotynylowane przeciwciała anty-ludzkie. Biotyna obecna na przeciwciałach ma wysokie powinowactwo do streptawidyny obecnej na kulkach magnetycznych. Powoduje to koniugację przeciwciał z kulkami magnetycznymi.

Następnie dodaj bogaty w białko roztwór blokujący do probówki zawierającej kulki magnetyczne znakowane przeciwciałami. Białka w roztworze blokującym wiążą się z wolnymi miejscami na kulkach magnetycznych i zwiększają specyficzność wiązania egzosomów.

Teraz uzupełnij probówkę próbką biopłynu bogatego w egzosomy. Inkubować probówkę z mieszaniem. Egzosomy w płynie biologicznym wykazują specyficzne receptory powierzchniowe, które pomagają im wiązać się z przeciwciałami przyczepionymi do powierzchni kulek magnetycznych.

Następnie umieść rurkę w polu magnetycznym. Pod wpływem pola magnetycznego kulki magnetyczne związane z egzosomem przyczepiają się do powierzchni rurki. Następnie za pomocą mikropipety odessać pozostały biopłyn z probówki.

Na koniec usuń rurkę z pola magnetycznego i dodaj odpowiedni bufor, aby wymyć kulki związane z egzosomami. Te kulki związane z egzosomami można wykorzystać do dalszej analizy.

Zawiesić roztwór podstawowy zawierający 10 mikrogramów na mililitr mikrocząstek magnetycznych pokrytych streptawidyną i dodać 5 mikrolitrów roztworu do probówki mikrowirówki zawierającej 495 mikrolitrów PBS. Aby umyć koraliki, najpierw umieść rurkę na stojaku magnetycznym na 1 minutę i ostrożnie wyjmij bufor, nie naruszając kulek.

Następnie przenieś rurkę na stojak niemagnetyczny. Dodaj 500 mikrolitrów PBS i odpipetuj do umycia kulek. Zrób to w sumie trzy razy. Po ostatnim myciu ponownie zawieś kulki w 490 mikrolitrach PBS, a następnie dodaj 5 mikrolitrów biotynylowanego mysiego przeciwciała anty-ludzkiego CD63 z 1 miligrama na mililitr roztworu podstawowego.

Wymieszać roztwór, pipetując. Zaprogramuj rotator próbki na obrót posuwisto-zwrotny pod kątem 90 stopni przez 5 sekund i wibracje pod kątem 5 stopni przez 1 sekundę. Umieść rurki w rotatorze i uruchom program na 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie przenieś probówki na stojak magnetyczny na 5 minut. Umyj koraliki trzykrotnie 500 mikrolitrami PBS, a następnie ponownie zawieś je w 490 mikrolitrach PBS zawierających kazeinę. Oznacz probówkę identyfikacją próbki, a następnie dodaj 10 mikrolitrów próbki.

Kilkakrotnie odpipetować próbkę, aby wymieszać ją z kulkami sprzężonymi z przeciwciałami. Następnie przenieś probówki do rotatora próbek i uruchom ten sam program przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie umyj kulki trzykrotnie 500 mikrolitrami 1M buforu tris-chlorowodorku za pomocą namagnesowanego stojaka. Egzosomy są teraz związane z namagnesowanymi koralikami.