Hodowla salisfer z tkanki gruczołów ślinowych: metoda rozwoju salisfer z komórek nabłonka pochodzących z ludzkich gruczołów ślinowych

Salisphere to in vitro, samoagregujące się kultury komórek nabłonkowych pochodzących z gruczołu ślinowego. Aby wyhodować salisphere, zacznij od pobrania tkanki ludzkiego gruczołu ślinowego na płytce hodowlanej.

Za pomocą nożyczek zmiel tkankę na drobne kawałki. Następnie uzupełnij te kawałki roztworem dysocjacyjnym zawierającym kolagenazę i enzymy dyspazy i inkubuj. Enzymy te trawią macierz zewnątrzkomórkową obecną w tkance.

Ponadto rozcierać w celu homogenizacji tkanki. Ten etap uwalnia komórki nabłonkowe i erytrocyty do roztworu. Następnie użyj sitka komórkowego i przefiltruj homogenat tkankowy do świeżej stożkowej probówki, aby usunąć niestrawione kawałki tkanek i zanieczyszczenia. Odwirować do granulowania komórek.

Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w buforze do lizy RBC. Bufor ten rozrywa erytrocyty obecne w zawiesinie komórki.

Teraz odwiruj, aby granulować komórki nabłonka. Zawiesić osad w odpowiednim podłożu do wzrostu komórek nabłonkowych. Dodatkowo przygotuj płytkę do hodowli salisphere, pokrywając ją dobrze upłynnioną matrycą błony podstawnej lub BMM. Inkubować, aby matryca mogła się zestalić.

Na koniec dodaj zawiesinę komórek nabłonka do studzienek pokrytych BMM. W obecności pożywki wzrostowej komórki nabłonkowe przyczepiają się do warstwy BMM i namnażają się w sferyczne salisfery.

W ciągu dwóch do czterech godzin po wyjęciu od pacjenta, na szalce hodowlanej, użyj wysterylizowanych w autoklawie nożyczek preparacyjnych i kleszczy chirurgicznych, aby zmielić tkankę gruczołu ślinowego na drobne kawałki o wielkości od 1 do 2 milimetrów. Dodaj 6 mililitrów roztworu dypazy/kolagenazy do zmielonej tkanki. Następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około 30 minut do jednej godziny.

Rozbić tkankę, pipetując pipetowaną pipetą serologiczną o pojemności 5 mililitrów, od 15 do 20 razy. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kolejne 30 minut do godziny. Powtórz etap pipetowania i inkubacji jeszcze dwa do trzech razy lub do momentu, gdy tkanka zacznie przypominać zawiesinę i będzie mogła łatwo przejść przez otwór pipety.

Aby pokryć studzienki BMM, powoli pipetuj 500 mikrolitrów rozmrożonego przez noc BMM do każdego dołka na 6-dołkowej płytce. Powoli obracaj płytą, aby równomiernie rozprowadzić BMM nad studzienkami. Następnie inkubuj powlekane płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 15 minut przed użyciem, aby umożliwić BMM zestalenie się.

Przenieść roztwór dypazy/kolagenazy zawierający homogenizowaną tkankę do 15-milimetrowej stożkowej probówki. Umyj ściankę płytki raz 6 mililitrami DPBS, aby przenieść pozostałe komórki do stożkowej probówki. Następnie, przez 70-mikrometrowe sitko z nylonowej siatki, przefiltruj homogenat do nowej 50-milimetrowej stożkowej probówki, aby usunąć niestrawioną tkankę.

Odwirować odcedzone komórki przez 5 minut przy 500 x g. Odessać supernatant. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 10 mililitrach 1x buforu do lizy RBC. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj od 20 do 25 milimetrów DPBS, aby zneutralizować bufor do lizy RBC i zminimalizować lizę komórek śliny.

Wirować przez 5 minut przy 500 x g. Osad z białych krwinek wskazuje na całkowitą lizę wszystkich krwinek czerwonych. Jeśli osad ma czerwony kolor, powtórzyć zabieg buforem do lizy RBC. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 do 2 mililitrach BEGM, a następnie przenieść zawieszone komórki do studzienek pokrytych BMM.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po posieciu na BMM komórki uformują się w kuliste struktury lub salisfery w ciągu dwóch do trzech dni. Komórki mogą być utrzymywane jako salisfery przez około pięć do siedmiu dni, zanim BMM zacznie ulegać degradacji, umożliwiając komórkom dostęp i przyleganie do plastiku oraz wzrost jako monowarstwa.