JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:17 min. • April 30th, 2023
Komórki macierzyste glejaka lub GSC to subpopulacja glejaka - nowotworu komórek glejowych w mózgu.
Znakowanie tych GSC enzymami bioluminescencyjnymi, takimi jak lucyferazy, pomaga w ustanowieniu wysokoprzepustowych testów obrazowania do badań przesiewowych leków.
Aby przygotować GSC znakowane lucyferazy, zacznij od hodowli GSC w odpowiednim pożywce wzrostowej.
Odwirować kulturę, aby uzyskać osad komórkowy i usunąć supernatant.
Do granulatu dodać odpowiednie enzymy trawienne. Enzymy te dysocjują skupiska komórek i degradują wszelkie ślady tkanki łącznej, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
Teraz odwiruj zawiesinę jednokomórkową i usuń supernatant. Zawiesić osad na świeżym podłożu.
Następnie wysiewaj pożądane stężenie komórek na płytce hodowlanej.
Inkubuj kulturę i pozwól komórkom przylegać do płytki hodowlanej.
Następnie dodać pożądane miano konstruktu genu zawierającego wirusa dla białka zielonej fluorescencji wzmocnionego lucyferazą lub EGFP i inkubować.
Wirus oddziałuje z receptorami powierzchniowymi GSC, wywołując uwalnianie wirusowego RNA zawierającego lucyferazę-EGFP. Enzymy komórkowe katalizują odwrotną transkrypcję RNA do dwuniciowego DNA i integrują go z genomem GSC.
Po wizualizacji pod mikroskopem fluorescencyjnym komórki wyrażające lucyferazy wydają się zielone z powodu fluorescencji emitowanej przez EGFP.
Rozpocznij od pobrania komórek macierzystych glejaka lub GSC z pożywki hodowlanej i odwirowania ich przy 70 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Po usunięciu supernatantu trawić komórki za pomocą akutazy przez 4 minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Używając końcówki o pojemności 200 mikrolitrów, kilkakrotnie pipetuj komórki, aby zdysocjować i ponownie zawiesić osad komórek. Dodaj GSC o gęstości 200 000 komórek w 1 mililitrze pożywki hodowlanej do każdej studzienki 12-dołkowej płytki hodowlanej i inkubuj je przez noc.
Następnego dnia dodaj 30 mikrolitrów supernatantu wirusa lucyferazy-EGFP do każdego dołka płytki. Odwirować komórki w temperaturze 1000 x g przez 2 godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza i inkubować je przez noc.
Następnego dnia należy wymienić pożywkę w studzienkach, zbierając GSC, odwirowując je, usuwając supernatant, ponownie umieszczając je w świeżej pożywce i ponownie platerując. Hoduj komórki przez kolejne 48 godzin.
Obserwuj płytkę pod mikroskopem fluorescencyjnym i potwierdź pojawienie się komórek GFP-dodatnich.