$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bioluminescencja komórkowa jest bardzo czułym i szybkim podejściem do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych na dużą skalę.
Technika ta wykorzystuje komórki nowotworowe wyrażające lucyferazy - enzym, który katalizuje reakcję chemiczną wytwarzającą światło, powodując, że komórki gospodarza świecą w ciemności. Intensywność emitowanej luminescencji jest wprost proporcjonalna do gęstości żywych komórek.
Na początek zasiej komórki wykazujące ekspresję lucyferazy na optycznie przezroczystej płytce hodowlanej pokrytej macierzą zewnątrzkomórkową lub ECM i inkubuj.
Podczas inkubacji ECM dobrze sprzyja przyłączaniu się komórek do hodowli.
Następnie weź skoncentrowane zapasy kombinacji leków i dodaj różne objętości pożywki hodowlanej, aby przygotować seryjne rozcieńczenie mieszaniny leków.
Teraz usuń pożywkę hodowlaną z przylegających komórek. Dodać różne rozcieńczenia kombinacji leków i inkubować.
Podczas inkubacji kombinacja leków działa synergistycznie na cele komórkowe.
Teraz usuń pożywkę zawierającą lek i dodaj świeżą pożywkę zawierającą lucyferynę.
Lucyferyna dyfunduje przez błonę i wnika do komórek. Lucyferazy wyrażane przez komórki wykorzystują komórkowe ATP do utleniania lucyferyny i emitowania sygnałów świetlnych.
Określ ilościowo bioluminescencję komórkową w systemie obrazowania.
Spadek emisji światła wraz ze wzrostem stężenia leku wskazuje na zmniejszoną żywotność komórek. Wiąże się to z antyproliferacyjnym działaniem leku na komórki docelowe.
Pokryj 96-dołkowe dolne płytki optyczne mieszaniną macierzy zewnątrzkomórkowej, taką jak Matrigel, i inkubuj je przez 1 godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń nadmiar mieszanki i delikatnie spłucz płytki raz za pomocą PBS.
Następnie wysiewaj komórki XG387-Luc o gęstości 1,000 komórek w 100 mikrolitrach pożywki hodowlanej do każdego dołka powlekanych płytek i hoduj je przez noc. Następnego dnia obserwuj komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić ich przyczepienie do płytki.
Następnie należy przygotować 200-mikromolowy roztwór temozolomidu i 2-mikromolowe roztwory docelowych środków w pożywce hodowlanej. W przypadku skojarzonych badań przesiewowych leków należy usunąć ślepą próbę i dodać pożywkę zawierającą 200-mikromolowy temozolomid lub 2-mikromolowy środek celowany, lub kombinację obu, do każdej studzienki w celu uzyskania 3 kontrprób technicznych na zabieg.
Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 3 dni. Wykonaj zdjęcia bioluminescencji komórkowej w płytce za pomocą systemu obrazowania widmowego IVIS. Korzystając z wbudowanego oprogramowania, utwórz wiele okrągłych obszarów obszaru zainteresowania i określ ilościowo bioluminescencję komórkową.