JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:05 min. • April 30th, 2023
Aby wyizolować i oczyścić nienaruszone jądra, zacznij od pobrania surowej frakcji jąder do probówki. Frakcja zawiera nienaruszone jądra wraz z połamanymi fragmentami jąder i szczątkami.
Zmieszać tę frakcję z odpowiednim podłożem o gradiencie gęstości, tak aby utworzyła zawiesinę o najniższym stężeniu.
Teraz roztwory warstwowe o rosnącej gęstości tego samego ośrodka gradientowego pod wstępnie przygotowaną frakcją jąder surowych w celu wygenerowania wieloetapowego nieciągłego gradientu gęstości. Ten krok pozwala frakcji jąder surowych uformować pasmo na szczycie gradientu.
Następnie odwiruj probówkę z niską prędkością.
Opierając się na różnicach w kształcie i masie, nienaruszone jądra migrują inaczej niż szczątki i fragmenty jądrowe. Powoduje to, że nienaruszone jądra tworzą osobne pasmo.
Po odwirowaniu zlokalizuj wyraźne pasmo składające się z nienaruszonych jąder na granicy roztworów gradientu gęstości.
Za pomocą pipety odessać górne warstwy gradientu, aby ułatwić dostęp do pasma czystych jąder. Zebrać prążek zawierający jądra do świeżej probówki.
Wizualizuj te jądra pod mikroskopem świetlnym. Nienaruszone jądra wydają się idealnie okrągłe z otaczającą je nienaruszoną błoną jądrową.
Na koniec przechowuj czystą frakcję jądrową do dalszej analizy.
Dodaj 200 mikrolitrów 50% roztworu jodiksanolu do jąder, aby uzyskać końcowe stężenie 25% jodiksanolu i wymieszaj 10 razy pipetą ustawioną na 300 mikrolitrów.
Następnie dodaj 300 mikrolitrów 29% roztworu jodu pod 25% mieszaninę za pomocą cienkiej końcówki P1000, aby uniknąć mieszania warstw. Dodaj 300 mikrolitrów 35% roztworu jodu pod 29% mieszaninę z cienką końcówką P1000. Następnie powoli go usuń.
Umieścić próbki w wirówce z odchylanym wiadrem i wirować je przez 20 minut w temperaturze 3 500 x g w temperaturze 4 stopni Celsjusza przy wyłączonym hamulcu.
Delikatnie usunąć próbki bez wstrząsania i obserwować je pod światłem. Między drugą a trzecią warstwą powinien być widoczny wyraźny biały pas jąder o czystości 95%.
Aby wyizolować jądra, należy zassać górne warstwy, aby odsłonić białe pasmo jąder na granicy faz. Zbierz pasmo jąder w objętości 200 mililitrów i przenieś je do świeżej probówki. Następnie przefiltruj go filtrem o długości 20 mikrometrów.
Sprawdź jądra pod mikroskopem świetlnym, aby sprawdzić, czy usunięto duże zanieczyszczenia i czy błona jądrowa jest nienaruszona. Powinny być okrągłe, a błona jądrowa nie powinna być zniekształcona.