JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 2:37 min • April 30th, 2023
Aby kriokonserwować próbkę mózgu myszy przez szybkie zamrażanie, zacznij od pobrania zlewki wypełnionej roztworem izopentanu - cieczą o wysokiej przewodności - i zanurz ją w słoiku zawierającym ciekły azot.
Zamrozić izopentan, aż roztwór stanie się lepki.
W międzyczasie weź całą próbkę mózgu myszy z przedrostkiem w roztworze sacharozy. Zabieg ten zapobiega deformacji tkanki mózgowej w kolejnych etapach.
Wyjmij próbkę mózgu z roztworu sacharozy i osusz ją, aby usunąć wszelkie ślady sacharozy.
Następnie umieść mózg w pożądanej orientacji w głębokim kriomold zawierającym warstwę podłoża osadzającego.
Nałóż mózg na kriomold z większą ilością osadzonych pożywek, aby upewnić się, że cały narząd jest pokryty.
Następnie zanurz kriomoder zawierający osadzony mózg we wstępnie schłodzonej kąpieli izopentanowej. Szybkie schładzanie tkanki mózgowej do bardzo niskiej temperatury zapewnia zachowanie architektury mózgu bez żadnych zniekształceń.
Teraz pozwól próbce mózgu zamrozić, aż osadzające podłoże zestali się, tworząc galaretowatą warstwę wokół mózgu, utrzymując go na miejscu.
Po zamrożeniu wyjmij kriomodr z kąpieli izopentanowej i zawiń kriokonserwowany mózg myszy w foliowy arkusz.
Przechowywać próbkę w temperaturze minus osiemdziesięciu stopni Celsjusza do dalszej analizy histologicznej.
Aby przygotować się do krioprezerwacji, napełnij słoik zimnym izopentanem/2-metylobutanem i umieść słoik w pojemniku wypełnionym ciekłym azotem. Podczas gdy rozpuszczalnik schładza się, osusz mózg na kawałku bibuły filtracyjnej i umieść mózg w oznakowanej krioformie.
Ostrożnie dodaj około 5 mililitrów środka do cięcia o optymalnej temperaturze do środka kriomoldu i umieść mózg w formie w pożądanej orientacji. Za pomocą czystych kleszczy szybko umieść kriomodan w schłodzonym izopentanie/2-metylobutanie na 30 do 40 sekund.
Gdy podłoże tnące zastygnie, przenieś kriomoder na suchy lód i zawiń kriomald oraz zamrożoną tkankę mózgową w folię aluminiową do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.