JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 4:00 min. • April 30th, 2023
Ubikwitynacja białek charakteryzuje się dodaniem ubikwityny - regulatorowego mini-białka - poprzez jej reszty di-glicyny do reszt lizyny białka substratowego. W ten sposób powstaje wiązanie lizyna-glicyna-glicyna między białkiem substratowym a ubikwityną.
Aby wyizolować peptydy znakowane ubikwityną, zacznij od przyjęcia mieszanki peptydów.
Potraktuj te peptydy koktajlem enzymów endonukleazy. Podczas leczenia enzymy Lys-C i trypsyna skutecznie rozszczepiają peptydy ubikwitynylowane na reszcie argininy, w wyniku czego powstają fragmenty peptydu zawierające charakterystyczny motyw di-glicyny.
Dodaj te fragmenty peptydów do zawiesiny kulek hydrożelowych sprzężonych z przeciwciałami.
Przeciwciała te zawierają miejsce rozpoznawania di-glicyny, które wiąże się wyłącznie z peptydami ubikwitynylowanymi, tworząc kompleks peptyd-kulka.
Wirówka do granulacji ubikwitynylowanych kompleksów peptyd-kulka. Usunąć niezwiązany, nieubikwitynylowany supernatant zawierający peptydy.
Załaduj kompleksy do zespołu filtrów. Odwirować w celu usunięcia buforu i wyłapania kulek sprzężonych z peptydami.
Dodaj zakwaszony odczynnik, który obniży pH, powodując odłączenie peptydów od kulek.
Odzyskać wolne peptydy z filtratu. Załaduj je do nowego filtra z hydrofobową matrycą. Peptydy zatrzymują się w matrycy, podczas gdy kwaśne sole są wypłukiwane.
Za pomocą odpowiedniego rozpuszczalnika odłącz peptydy.
Przenieś ubikwitynylowane peptydy do świeżej probówki i wysusz je, aby usunąć wszelkie ślady rozpuszczalnika.
Jedna partia przeciwciał przeciwko motywowi resztkowemu ubikwityny sprzężonej z białkiem Zawiesina kulki agarozy jest dzielona na sześć równych frakcji. Rozpuść trzy frakcje peptydowe zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i odwiruj szczątki.
Dodać supernatanty trzech frakcji do zawiesiny kulek, trzymając pozostałe trzy frakcje na lodzie i inkubować je przez 2 godziny w temperaturze 4 stopni Celsjusza na jednostce rotatora.
Następnie odkręć koraliki. Przenieść supernatant do świeżej partii kulek i powtórzyć inkubację z pozostałymi trzema frakcjami zawiesiny kulek.
Przechowuj supernatanty do późniejszej globalnej analizy proteomu i przenieś kulki do końcówek pipet o pojemności 200 mikrolitrów wyposażonych w zatyczkę filtrującą GF/F.
Umieść końcówki w 1,5-mililitrowych probówkach wyposażonych w adapter końcówki wirówki i umyj kulki trzykrotnie 200 mikrolitrami lodowatego buforu IAP, a następnie trzykrotnie przepłucz lodowatą oczyszczoną wodą.
Wiruj kolumny w temperaturze 200 x g przez 2 minuty między praniami, uważając, aby kolumna nie wyschła. Po ostatnim płukaniu eluować peptydy w dwóch cyklach po 50 mikrolitrów 0,15% TFA. Odsolić peptydy za pomocą końcówki stolika C18 i wysuszyć je za pomocą wirowania próżniowego.