Ekstrakcja peptydów ubikwitynylowanych na podstawie powinowactwa immunologicznego: technika selektywnej ekstrakcji peptydów oznaczonych ubikwityną z oczyszczonych frakcji peptydowych

0 wyświetleń4:00 min • April 30th, 2023

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ubikwitynacja białek charakteryzuje się dodaniem ubikwityny - regulatorowego mini-białka - poprzez jej reszty di-glicyny do reszt lizyny białka substratowego. W ten sposób powstaje wiązanie lizyna-glicyna-glicyna między białkiem substratowym a ubikwityną.

Aby wyizolować peptydy znakowane ubikwityną, zacznij od przyjęcia mieszanki peptydów.

Potraktuj te peptydy koktajlem enzymów endonukleazy. Podczas leczenia enzymy Lys-C i trypsyna skutecznie rozszczepiają peptydy ubikwitynylowane na reszcie argininy, w wyniku czego powstają fragmenty peptydu zawierające charakterystyczny motyw di-glicyny.

Dodaj te fragmenty peptydów do zawiesiny kulek hydrożelowych sprzężonych z przeciwciałami.

Przeciwciała te zawierają miejsce rozpoznawania di-glicyny, które wiąże się wyłącznie z peptydami ubikwitynylowanymi, tworząc kompleks peptyd-kulka.

Wirówka do granulacji ubikwitynylowanych kompleksów peptyd-kulka. Usunąć niezwiązany, nieubikwitynylowany supernatant zawierający peptydy.

Załaduj kompleksy do zespołu filtrów. Odwirować w celu usunięcia buforu i wyłapania kulek sprzężonych z peptydami.

Dodaj zakwaszony odczynnik, który obniży pH, powodując odłączenie peptydów od kulek.

Odzyskać wolne peptydy z filtratu. Załaduj je do nowego filtra z hydrofobową matrycą. Peptydy zatrzymują się w matrycy, podczas gdy kwaśne sole są wypłukiwane.

Za pomocą odpowiedniego rozpuszczalnika odłącz peptydy.

Przenieś ubikwitynylowane peptydy do świeżej probówki i wysusz je, aby usunąć wszelkie ślady rozpuszczalnika.

Jedna partia przeciwciał przeciwko motywowi resztkowemu ubikwityny sprzężonej z białkiem Zawiesina kulki agarozy jest dzielona na sześć równych frakcji. Rozpuść trzy frakcje peptydowe zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i odwiruj szczątki.

Dodać supernatanty trzech frakcji do zawiesiny kulek, trzymając pozostałe trzy frakcje na lodzie i inkubować je przez 2 godziny w temperaturze 4 stopni Celsjusza na jednostce rotatora.

Następnie odkręć koraliki. Przenieść supernatant do świeżej partii kulek i powtórzyć inkubację z pozostałymi trzema frakcjami zawiesiny kulek.

Przechowuj supernatanty do późniejszej globalnej analizy proteomu i przenieś kulki do końcówek pipet o pojemności 200 mikrolitrów wyposażonych w zatyczkę filtrującą GF/F.

Umieść końcówki w 1,5-mililitrowych probówkach wyposażonych w adapter końcówki wirówki i umyj kulki trzykrotnie 200 mikrolitrami lodowatego buforu IAP, a następnie trzykrotnie przepłucz lodowatą oczyszczoną wodą.

Wiruj kolumny w temperaturze 200 x g przez 2 minuty między praniami, uważając, aby kolumna nie wyschła. Po ostatnim płukaniu eluować peptydy w dwóch cyklach po 50 mikrolitrów 0,15% TFA. Odsolić peptydy za pomocą końcówki stolika C18 i wysuszyć je za pomocą wirowania próżniowego.

10:50

Izolacja labilnych kompleksów wielobiałkowych za pomocą kontrolowanego in vivo sieciowania komórkowego i immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

07:28

Wzbogacanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej z tkanek i trawienie do peptydów do analizy spektrometrii mas

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

09:03

Charakterystyka białek komórkowych za pomocą szybkiego fotochemicznego utleniania białek w komórce

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

09:00

Wykrywanie ubikwitynacji białek

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

06:09

Kwantyfikacja białek za pomocą wzbogacania immunopowinowactwa peptydów w połączeniu ze spektrometrią mas

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

10:37

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

08:12

Wykorzystanie kompleksowego systemu wzbogacania immunoprecypitacji w celu zidentyfikowania endogennego profilu modyfikacji potranslacyjnej dla białek docelowych

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

11:54

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

10:26

Profilowanie ubikwityny i zależnych od ubikwityny modyfikacji potranslacyjnych oraz identyfikacja istotnych zmian

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

08:33

Analiza łańcucha ubikwityny za pomocą równoległego monitorowania reakcji

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

Ostatnia aktualizacja: 1 sierpnia 2026