JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 4:00 min. • April 30th, 2023
Ubikwitynacja białek charakteryzuje się dodaniem ubikwityny - regulatorowego mini-białka - poprzez jej reszty di-glicyny do reszt lizyny białka substratowego. W ten sposób powstaje wiązanie lizyna-glicyna-glicyna między białkiem substratowym a ubikwityną.
Aby wyizolować peptydy znakowane ubikwityną, zacznij od przyjęcia mieszanki peptydów.
Potraktuj te peptydy koktajlem enzymów endonukleazy. Podczas leczenia enzymy Lys-C i trypsyna skutecznie rozszczepiają peptydy ubikwitynylowane na reszcie argininy, w wyniku czego powstają fragmenty peptydu zawierające charakterystyczny motyw di-glicyny.
Dodaj te fragmenty peptydów do zawiesiny kulek hydrożelowych sprzężonych z przeciwciałami.
Przeciwciała te zawierają miejsce rozpoznawania di-glicyny, które wiąże się wyłącznie z peptydami ubikwitynylowanymi, tworząc kompleks peptyd-kulka.
Wirówka do granulacji ubikwitynylowanych kompleksów peptyd-kulka. Usunąć niezwiązany, nieubikwitynylowany supernatant zawierający peptydy.
Załaduj kompleksy do zespołu filtrów. Odwirować w celu usunięcia buforu i wyłapania kulek sprzężonych z peptydami.
Dodaj zakwaszony odczynnik, który obniży pH, powodując odłączenie peptydów od kulek.
Odzyskać wolne peptydy z
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych