JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:22 min. • April 30th, 2023
Na początek weź probówkę zawierającą nienaruszone pęcherzyki zewnątrzkomórkowe lub EV.
Zawiesić EV w żądanej objętości buforu do lizy i poddać próbkę sonikacji. Zabieg ten powoduje lizę błony EV i ścinanie materiału genetycznego, uwalniając białka do buforu.
Wirówka do granulowania resztek komórkowych i ściętego materiału genetycznego. Zebrać supernatant zawierający różne białka.
Dodaj barwnik ładujący do ekstraktu białkowego i uruchom go na żelu SDS-PAGE.
Namocz żel w roztworze barwiącym, aby cząsteczki barwnika mogły związać białka. Zlokalizuj wybarwiony pasek zawierający pożądane białko i wytnij go.
Pokrój kolorową opaskę na małe kawałki, aby poprawić dostępność białek dla enzymów w kolejnych krokach. Przenieś te kawałki do probówki mikrowirówkowej.
Dodaj roztwór odbarwiający, który usuwa barwnik barwiący. Usuń zużyty roztwór odbarwiający.
Dodaj roztwór redukcyjny. Inkubować, aby środek redukujący mógł rozszczepić wiązania dwusiarczkowe w białku, odsłaniając wolne grupy sulfhydrylowe.
Potraktuj zredukowane białka roztworem alkilującym. Grupy alkilowe wiążą się z wolnymi grupami sulfhydrylowymi, utrzymując białko w stanie rozwiniętym.
Wylej nadmiar roztworu i umyj kawałki roztworem odwadniającym, aby usunąć odczynnik alkilowy. Całkowicie wysusz żel.
Kawałki żelu są teraz gotowe do dalszej analizy proteomicznej.
W celu ekstrakcji białka wymieszać 50 mikrolitrów buforu RIPA z próbką EV przez 5 minut na lodzie. Poddaj próbkę trzykrotnemu sonifikacji z mocą 500 watów i 20 kilohercami przez 5 sekund. Następnie usuń zanieczyszczenia pęcherzykowe, odwirowując przy 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Po wyizolowaniu białek należy przeprowadzić migrację białek w żelu do układania w stos 12% żelu poliakrylamidowego. Utrwal białka w żelu za pomocą Coomassie blue przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wyciąć każdy kolorowy kawałek żelu i pokroić go na małe kawałki.
Przełóż kawałki żelu przez serię kolejnych myć, zgodnie z opisem w rękopisie. Następnie wysusz je całkowicie za pomocą koncentratora próżniowego. Po wysuszeniu przeprowadzić redukcję białka za pomocą 100 mikrolitrów 100-milimolowego wodorowęglanu amonu zawierającego 10-milimolowy ditiotreitol przez 1 godzinę w temperaturze 56 stopni Celsjusza.
Następnie wykonaj alkilowanie białek 100 mikrolitrami 100-milimolowego wodorowęglanu amonu zawierającego 50-milimolowy jodoacetamid przez 45 minut w ciemności. Umyj kawałki żelu zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i całkowicie wysusz je na koncentratorze próżniowym.