Ekstrakcja białek związanych z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi oparta na SDS-PAGE: procedura ekstrakcji białek z EV i przygotowania ich do trawienia w żelu

Na początek weź probówkę zawierającą nienaruszone pęcherzyki zewnątrzkomórkowe lub EV.

Zawiesić EV w żądanej objętości buforu do lizy i poddać próbkę sonikacji. Zabieg ten powoduje lizę błony EV i ścinanie materiału genetycznego, uwalniając białka do buforu.

Wirówka do granulowania resztek komórkowych i ściętego materiału genetycznego. Zebrać supernatant zawierający różne białka.

Dodaj barwnik ładujący do ekstraktu białkowego i uruchom go na żelu SDS-PAGE.

Namocz żel w roztworze barwiącym, aby cząsteczki barwnika mogły związać białka. Zlokalizuj wybarwiony pasek zawierający pożądane białko i wytnij go.

Pokrój kolorową opaskę na małe kawałki, aby poprawić dostępność białek dla enzymów w kolejnych krokach. Przenieś te kawałki do probówki mikrowirówkowej.

Dodaj roztwór odbarwiający, który usuwa barwnik barwiący. Usuń zużyty roztwór odbarwiający.

Dodaj roztwór redukcyjny. Inkubować, aby środek redukujący mógł rozszczepić wiązania dwusiarczkowe w białku, odsłaniając wolne grupy sulfhydrylowe.

Potraktuj zredukowane białka roztworem alkilującym. Grupy alkilowe wiążą się z wolnymi grupami sulfhydrylowymi, utrzymując białko w stanie rozwiniętym.

Wylej nadmiar roztworu i umyj kawałki roztwor