JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:07 min • April 30th, 2023
Obrazowanie przyżyciowe za pomocą okien obrazowania optycznego ułatwia śledzenie pojedynczych komórek w wysokiej rozdzielczości w celu zbadania ich zachowania w rodzimym mikrośrodowisku u żywego zwierzęcia.
Na początek weźmy znieczuloną mysz z mózgiem wstępnie wstrzykniętym komórkami rakowymi i z wszczepionym oknem czaszkowym mieszczącym się w metalowym pierścieniu. Komórki rakowe wyrażają jądrowe białka fluorescencyjne.
Umieść mysz ekranem do góry w polu obrazowania. Uchwyt magnetyczny w pudełku do obrazowania pomaga zabezpieczyć wszczepione okno czaszki.
Teraz przenieś pudełko do obrazowania do kontrolowanej środowiskowo komory obrazowania odwróconego mikroskopu, aby przeanalizować zachowanie komórek rakowych w mózgu.
W trybie wielofotonowym ustaw laser na odpowiednią długość fali. Skoncentruj się na regionie guza, aby wykryć fluorescencję komórek rakowych.
Zdefiniuj stos z dla każdej pozycji, aby uzyskać wiele przyżyciowych obrazów komórek nowotworowych w różnych płaszczyznach optycznych.
Ten etap umożliwia wychwycenie znacznej części komórek nowotworowych w mikrośrodowisku guza bez wpływu na rozdzielczość komórek.
Następnie uzyskuj obrazy z różnych pozycji guza przez dłuższy czas.
Śledzenie ścieżki komórek nowotworowych w różnych płaszczyznach optycznych pomaga określić migrację poszczególnych komórek nowotworowych za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
W odpowiednim eksperymentalnym punkcie czasowym umieść mysz ekranem do góry w pudełku do obrazowania i ustaw obiektyw wodny 25x w najniższej pozycji z. Dodaj dużą kroplę wody do obiektywu i przenieś pudełko do obrazowania do ciemnej komory klimatycznej mikroskopu o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Przyłóż obiektyw do szkiełka nakrywkowego w okienku obrazowania czaszki, aż kropla wody dotknie szkiełka nakrywkowego, a następnie w trybie epifluorescencji obserwuj guz przez okular, aby ustawić ostrość komórek.
Dostrój laser do odpowiedniej długości fali i wybierz tryb na żywo. Po wybraniu kilku interesujących pozycji do obrazowania, zapisz ich współrzędne w oprogramowaniu. Zdefiniuj stos z dla każdej pozycji, aby uzyskać maksymalną objętość komórek nowotworowych bez uszczerbku dla rozdzielczości komórek nowotworowych, z rozmiarem kroku między obrazami ustawionym na 3 mikrometry.
Następnie uzyskuj obrazy objętości guza w różnych pozycjach co 20 minut przez 2 godziny, dodając wodę do obiektywu przed każdym akwizycją obrazu. Po uzyskaniu ostatniego obrazu przenieś mysz na poduszkę grzewczą z monitorowaniem aż do pełnego odzyskania.