JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 2:54 min. • April 30th, 2023
Rozpocznij od pobrania płytki wielodołkowej zawierającej przylegające komórki.
Potraktuj te komórki pożywką zawierającą tritiowaną tymidynę - radioaktywną wersję tymidyny - i inkubuj.
Podczas inkubacji aktywnie replikujące się komórki zawierają radioaktywną tymidynę. Ta tymidyna paruje się naprzeciwko adenozyny, generując znakowane radioaktywnie DNA w proliferujących komórkach.
Usuń zużyte media ze studzienek. Dodaj bufor do lizy, aby zlizować komórki i uwolnić DNA do zawiesiny.
Przygotuj zespół kombajnu komórkowego, umieszczając rurki zbiorcze kombajnu nad dołkami mikropłytki.
Zastosuj ciśnienie ssania, aby umożliwić aspirację zawieszonego DNA ze studzienek. To DNA osadza się na bibule filtracyjnej, tworząc określone plamki.
Wytnij szaty z bibuły filtracyjnej z plamkami DNA. Przenieść te czady pojedynczo do fiolek scyntylacyjnych.
Na bibułę filtracyjną nałożyć koktajl scyntylacyjny. Umieścić fiolkę w płynnym liczniku scyntylacyjnym.
Wewnątrz licznika znakowane DNA emituje energię w wyniku rozpadu radioaktywnego. Energia ta jest pochłaniana przez składniki koktajlu scyntylacyjnego. W końcu składniki koktajlu zaczynają przenosić impulsy, które z kolei są pochłaniane przez czujnik.
Ilość wykrytej radioaktywności określa zakres podziału komórki.
Umieść 100 000 komórek w trzech dołkach na płytce 24-dołkowej. Po 46 godzinach dodaj tritiowaną tymidynę do pożywki hodowlanej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 2 godziny.
Następnie, po usunięciu pożywki, dodaj 300 mikrolitrów wstępnie podgrzanej 0,25% trypsyny-EDTA i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby rozbić komórki i uwolnić DNA. Następnie włącz kombajn do kombajnów i pompę.
Umieść bibułę filtracyjną w kombajnie do komórek. Kontynuuj zbieranie probówek kombajnu komórkowego na pustą pustą tacę. Następnie naciśnij mycie wstępne, aby zwilżyć bibułę filtracyjną. Umieść probówki zbiorcze w dołkach na próbki i zacznij.
Użyj gorącego źródła światła, aby wysuszyć bibułę filtracyjną i ułóż odpowiednie fiolki na tacy. Wybij papierowe płytki do fiolek, a następnie dodaj 2 mililitry płynnego koktajlu scyntylacyjnego do każdej fiolki.
Inkubować fiolki przez 1 godzinę w liczniku scyntylacyjnym przed uruchomieniem maszyny, aby uzyskać liczbę na minutę każdej próbki, która odzwierciedla aktywną syntezę DNA.