JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 4:02 min. • April 30th, 2023
Neurosfery to nieprzylegające kuliste agregaty nerwowych komórek prekursorowych lub NPC.
Po posianiu w określonych warunkach hodowli przylegającej, NPC mogą spontanicznie migrować z neurosfery.
Aby ocenić reakcję migracyjną NPC, najpierw przygotuj zawiesinę NPC o pożądanej gęstości w odpowiednim podłożu.
Następnie wysiewaj zawiesinę komórkową na płytce hodowlanej zawierającej pożywkę i inkubuj.
Specyficzne czynniki wzrostu w pożywkach wspomagają proliferację komórek. Dodatkowo, brak podłoża powlekającego utrzymuje komórki zawieszone w pożywkach, ułatwiając im tworzenie agregatów komórek 3D zwanych neurosferami.
Po osiągnięciu pożądanego rozmiaru zbierz neurosfery.
Odwirować i ponownie zawiesić osad neurosfery w rozcieńczonym podłożu.
Następnie umieść zawiesinę neurosfery na płytce pokrytej macierzą zewnątrzkomórkową zawierającą rozcieńczone podłoże i inkubuj.
Podczas hodowli neurosfery przylegają do macierzy zewnątrzkomórkowej.
Z biegiem czasu, ze względu na składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, kilka NPC zaczyna migrować z dala od rdzenia neurosfery.
Teraz wyjmij nośnik i napraw komórki.
Uchwyć obrazy z kontrastem fazowym neurosfer wykazujących migrację komórek.
Za pomocą odpowiedniego oprogramowania zmierz powierzchnię całkowitej neurosfery i wewnętrzną masę komórki.
Na koniec odejmij wewnętrzną powierzchnię masy komórkowej od całkowitego obszaru neurosfery, aby obliczyć średnią migrację NPC z neurosfery.
Aby uformować neurosferę, należy odpipetować 1 mililitr 100% pożywki eksplatacyjnej do 35-milimetrowego naczynia bez żadnego podłoża powlekającego. Następnie dodaj milion nerwowych komórek prekursorowych do każdej z tych płytek i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 do 96 godzin.
Aby przygotować płytkę do migracji neurosfery, rozpuść podwielokrotności żelu naśladującego ECM w 6 mililitrach 30% podłoża ekspandacyjnego. Dodaj 1 mililitr żelu naśladującego ECM z 30% podłożem ekspansywnym do jednego dołka 6-dołkowej płytki. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.
Aby pokryć neurosfery, użyj pipety, aby zebrać komórki w pożywce z 35-milimetrowej naczynia i przenieść je do stożkowej probówki. Następnie obróć rurkę o masie 100 x g, aby nabrać granulki na neurosfery. Następnie ponownie zawieś granulat w 1 do 3 mililitrach podgrzanego 30% podłoża rozprężnego.
Następnie odpipetować 200 mikrolitrów zawieszonych neurosfer do 6-dołkowej płytki zawierającej żel naśladujący ECM z 30% podłożem ekspandacyjnym i wstrząsnąć płytką. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Odessać żel naśladujący ECM z 30% podłożem ekspansywnym, a następnie utrwalić komórki przez 30 minut za pomocą 4% paraformaldehydu.
Aby przeanalizować neurosfery, uchwyć obrazy przy użyciu ustawień kontrastu fazowego przy 10-krotnym powiększeniu. Użyj oprogramowania NIH ImageJ, aby zmierzyć średnią migrację neurosfer. Na ImageJ użyj narzędzia linii odręcznej, aby obrysować zewnętrzny kontur neurosfery.
Następnie użyj funkcji miary, aby obliczyć obszar śladu i prześledzić wewnętrzną masę komórkową kuli. Odejmij wewnętrzną masę komórki od całkowitej powierzchni neurosfery, aby określić ilościowo średnią migrację.