Izolacja astrocytów: metoda uzyskiwania czystego przygotowania astrocytów korowych myszy

Hodowla astrocytów in vitro pomaga badać biologiczną rolę astrocytów - najliczniejszych komórek mózgowych.

Zacznij od mózgu nowonarodka myszy umieszczonego pod mikroskopem preparacyjnym.

Usuń opuszki węchowe i móżdżek.

Wykonaj nacięcie w linii środkowej między dwiema półkulami, aby oddzielić korę.

Usuń opony mózgowe, aby uniknąć zanieczyszczenia w hodowli astrocytów przez fibroblasty i komórki opon

Przenieś półkule kory mózgowej do lodowatego podłoża i zmiel na małe kawałki.

Zbierz kawałki kory mózgowej w probówce zawierającej trypsynę. Trypsyna, enzym proteazy, trawi białka adhezyjne komórek, ułatwiając separację komórek.

Wirować w celu granulowania strawionej tkanki.

Usunąć supernatant i dodać pożywkę astrocytów do osadu. Energicznie pipetować, aby uwolnić mieszaną populację komórek astrocytów, mikrogleju i komórek prekursorowych oligodendrocytów lub OPC.

Zawiesinę komórkową należy rozsiać w kolbie do hodowli tkankowej pokrytej polilizyną i inkubować.

Ujemnie naładowane komórki przyłączają się do dodatnio naładowanej polilizyny i rosną na całej powierzchni, tworząc zlewającą się warstwę.

Potrząsnąć kolbą, aby odłączyć luźno związany mikroglej i OPC. Usunąć supernatant zawierający oderwane komórki.

Dodaj trypsynę do warstwy astrocytów. Zebrać komórki i odwirować.

Ponownie zawiesić osad i podzielić astrocyty na wiele kolb.

Na koniec oceń czystość hodowli astrocytów poprzez immunobarwienie markerów specyficznych dla komórek.

Przenieś naczynie zawierające mózgi do mikroskopu stereoskopowego. Następnie, aby wyizolować korę, chwyć tylny koniec każdego mózgu cienkimi kleszczami i wykonaj nacięcie w linii środkowej między półkulami.

Następnie włóż drugi zestaw kleszczy do utworzonego rowka i oderwij płytkowatą strukturę kory mózgowej od reszty mózgu.

Po wyizolowaniu wszystkich kory ostrożnie oderwij opony mózgowe od kory, ciągnąc cienkimi kleszkami. Ten etap pozwala uniknąć zanieczyszczenia końcowej hodowli astrocytów komórkami opon mózgowych i fibroblastami.

Przenieś przygotowane półkule korowe do drugiego naczynia wypełnionego schłodzonym HBSS i umieść na lodzie. Kontynuuj odpowiednio ze wszystkimi czterema korami. Na koniec pokrój każdą półkulę na cztery do ośmiu małych kawałków za pomocą ostrych ostrzy.

W sterylnych warunkach przenieś kawałki kory do jednej 50-mililitrowej probówki Falcon i dodaj HBSS do końcowej objętości 22,5 mililitra. Następnie dodaj 2,5 mililitra 2,5% trypsyny.

Załóż nakrętkę, wymieszaj i inkubuj tkankę w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Mieszaj wstrząsając co 10 minut. Następnie, po odwirowaniu przez 5 minut przy 300 x g w celu osadzenia kawałków tkanki kory, ostrożnie zdekantować supernatant.

Dodaj 10 mililitrów pożywki do posiewu astrocytów do osadu i użyj 10-mililitrowej pipety, aby energicznie pipetować pożywkę zawierającą tkankę w górę iw dół 20 do 30 razy, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.

Następnie dodaj pożywkę do posiewu astrocytów do końcowej objętości 20 mililitrów i policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek zgodnie ze standardowymi procedurami.

Jedno przygotowanie czterech kory mózgowej szczeniąt myszy powinno dać od 10 do 15 razy 10 do szóstej zdysocjowanej pojedynczej komórki. Na koniec odessać poli-D-lizynę z wcześniej przygotowanej kolby i przenieść zdysocjowaną zawiesinę komórek do kolby.

Inkubować kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 2 dni, a następnie zmienić pożywkę. Następnie podłoże należy wymieniać co 3 dni.

Astrocyt powinien wydawać się zlewający się z leżącą nad nim warstwą mikrogleju po 7 do 8 dniach w hodowli. W tym momencie ustaw kolbę T75 na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 180 obrotów na minutę przez 30 minut, aby usunąć mikroglej.

Odrzucić supernatant zawierający mikroglej lub odwirować go i poszczepić na płytce w celu uzyskania posiewu. Następnie dodać 20 mililitrów świeżej pożywki do hodowli astrocytów i kontynuować, potrząsając kolbą z prędkością 240 obr./min przez 6 godzin, aby usunąć komórki prekursorowe oligodendrocytów.

Ponieważ niektóre OPC nie odłączają się całkowicie od warstwy astrocytów, kontynuuj energiczne potrząsanie ręką przez 1 minutę, aby zapobiec zanieczyszczeniu OPC. Ponownie wyrzuć supernatant lub odkręć go na płytce, aby wyhodować OPC.

Przepłucz pozostałą warstwę zlewających się astrocytów dwukrotnie za pomocą PBS. Odessać PBS i dodać 5 mililitrów trypsyny-EDTA. Inkubować w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Sprawdzaj, czy astrocyty nie odrywają się co 5 minut i wymuszaj oderwanie astrocytów, uderzając kolbą o dłoń dwa do trzech razy.

Gdy astrocyty odłączą się od kolby, dodaj 5 mililitrów pożywki do hodowli astrocytów. Wiruj komórki w masie 180 x g przez 5 minut, odessaj supernatant i dodaj 40 mililitrów świeżej pożywki do posiewu astrocytów.

Jedna kolba T75 z mieszanymi komórkami korowymi powinna dać około 1 razy 10 do szóstych komórek wzbogaconych o astrocyty po pierwszym pasażu.