Hodowla komórek śródbłonka z mikronaczyń mózgu szczura: procedura izolacji i hodowli komórek śródbłonka z mikronaczyń mózgu szczura

Aby wyizolować komórki śródbłonka mózgu, najpierw przenieś pobrany mózg szczura do naczynia zawierającego schłodzony bufor.

Po usunięciu móżdżku i nerwów wzrokowych podziel mózg na półkule mózgowe. Następnie oddziel śródmózgowie od przodomózgowia.

Usuń opony mózgowe i istotę białą zawierającą mielinę z przodomózgowia, pozostawiając korę mózgową do izolacji mikronaczyń.

Następnie homogenizuj korę, aby rozbić tkankę nerwową i składniki.

Odwirować homogenat w celu usunięcia resztek komórkowych i mieliny.

Następnie należy potraktować osad tkankowy koktajlem trawiennym zawierającym kolagenazę, enzymy dyspazę i dezoksyrybonukleazę.

Kolagenazy i dyzazy trawią macierz zewnątrzkomórkową, która osadza mikronaczynia, rozluźniając fragmenty mikronaczyń z tkanki. Deoksyrybonukleazy rozkładają wolne DNA uwalniane z komórek poddanych lizie.

Wymieszać żądaną objętość strawionego homogenatu z pożywką o odpowiednim gradimencie gęstości i odwirować.

Odrzuć mielinę i najwyższą warstwę zawierającą komórki miąższowe mózgu, a następnie supernatant.

Teraz potraktuj osad zawierający mikronaczynie koktajlem wytrawiającym, aby całkowicie uwolnić fragmenty mikronaczyń zawierające komórki śródbłonka i perycyty.

Odwirować zawiesinę. Zawiesić osad zawierający fragment mikronaczynia w odpowiednim podłożu uzupełnionym puromycyną - antybiotykiem.

Wysiewać zawiesinę na płytkę pokrytą białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej i inkubować.

Fragmenty mikronaczyń przylegają do powłoki w płytce. Puromycyna selektywnie eliminuje perycyty, a składniki pożywki ułatwiają proliferację komórek śródbłonka.

Usuń mózg z czaszki trzech 5-tygodniowych szczurów rasy Wistar i przenieś je na szalkę Petriego wypełnioną zimnym buforem preparacyjnym trzymanym na lodzie.

Wypreparuj mózgi bez móżdżku i nerwów wzrokowych. Następnie przetnij każdy mózg na pół, aby oddzielić dwie półkule mózgowe.

Pod mikroskopem stereoskopowym wykonaj kolejne cięcie, aby usunąć śródmózgowie i przenieś wszystkie przodomózgowie na czystą szalkę Petriego na lodzie z buforem preparacyjnym

.

Następnie przenieś jedno przodomózgowie na nową szalkę Petriego wypełnioną zimnym buforem preparacyjnym. Przytrzymaj go zaciskiem i ostrożnie odłącz opony mózgowe od krawędzi przodomózgowia.

Następnie odwróć przodomózgowie i ostrożnie oderwij opony mózgowe, nie rozrywając ich. Upewnij się, że przodomózgowie jest oczyszczone z opon mózgowych i odetnij pozostałą część nerwów wzrokowych. Celem tego etapu jest usunięcie kołdry z istoty białej w celu uzyskania powłoki kory mózgowej.

Zacznij od zaciśnięcia przodomózgowia na krawędzi, a następnie ostrożnie przeciągnij kleszcze po powierzchni, uważając, aby nie rozerwać powierzchni kory.

Następnie upewnij się, że mózg jest wolny od opon mózgowych, przewracając go, aby sprawdzić, czy nie ma szczątkowych opon mózgowych lub dużych naczyń powierzchniowych.

Następnie, począwszy od ekstrakcji trzech mózgów z ich czaszki, pełny czas na sekcję nie powinien zająć więcej niż 2 godziny na zachowanie tkanek i przeżycie komórek. Przenieś korę trzech mózgów do 6 mililitrów zimnego buforu preparacyjnego w 7-mililitrowym homogenizatorze Dounce.

Następnie rozdziel korę za pomocą 10 ruchów w górę iw dół pierwszym tłuczkiem o większym prześwicie, a następnie 10 ruchami w górę iw dół drugim tłuczkiem o mniejszym prześwicie.

Następnie przenieś 6 mililitrów zawiesiny do nowej 50-mililitrowej rurki Falcon i umyj homogenizator Dounce 24 mililitrami zimnego buforu rozwarstwiającego. Podziel zawiesinę na trzy rurki Falcona, aby uzyskać odpowiednik jednej kory na rurkę.

Następnie odwirować przy 1000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Obserwacja osadu pokazuje gradient różowego koloru, który reprezentuje część mikronaczynia homogenatu kory

.

Teraz wyrzuć supernatant i homogenizuj osad z jednej kory za pomocą 1 mililitra roztworu enzymatycznego zawierającego mieszaninę kolagenaz, dyspazy, DNazy typu 1 i gentamycyny.

Umieść probówki w shakerze na 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie wymieszaj 1 mililitr trawienia z 10 mililitrami 25% BSA/HBSS 1X i delikatnie zwiruj probówki. Następnie oddzielić je przez odwirowanie w zależności od gęstości przy 3 600 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Po odwirowaniu zależnym od gęstości osad zawiera mikronaczynia, a górny dysk zawiera mielinę, miąższ mózgu i resztkowe mikronaczynia.

Ostrożnie przenieść górny krążek i supernatant do czystych 50-mililitrowych probówek Falcona; należy uważać, aby nie zassać osadu z mikronaczynia.

Delikatnie zwirować probówkę i powtórzyć wirowanie w zależności od gęstości. Podczas tego drugiego wirowania utrzymuj powstały osad zawierający mikronaczynia w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Po drugim odwirowaniu zależnym od gęstości ostrożnie wyrzucić górny krążek i supernatant. Wymieszaj i ponownie zawieś powstałe granulki zawierające mikronaczynia z obu wirówek z 1 mililitrem zimnego HBSS 1X.

Następnie umyj mikronaczynia 20 mililitrami zimnego HBSS 1X i odwiruj przy 1,000 x g przez 5 minut. Następnie wyrzucić supernatant, uważając, aby nie stracić osadu z mikronaczynia.

Homogenizuj osad mikronaczynia z jednej kory za pomocą 1 mililitra tego samego roztworu enzymatycznego po delikatnym wirze rurek. Następnie trawić mikronaczynia przez 1 godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w shakerze. Następnie wymieszaj strawione mikronaczynia z trzech kory mózgowej w jednej probówce.

Ponownie rozdziel mieszaninę na dwie 50-mililitrowe probówki Falcona, aby uzyskać mikronaczynia wyekstrahowane z odpowiednika półtorej kory na probówkę. Następnie odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.

Tuż przed posiewem mikronaczyń należy wyjąć z inkubatora dwie powlekane kolby T75 i odessać nadmiar powłoki. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad z mikronaczyniem w 1 mililitrze ECM.

Doprowadzić każdą probówkę do 10 mililitrów za pomocą ECM uzupełnionego 4 mikrogramami na mililitr puromycyny, aby rozpocząć proces oczyszczania i umieścić mikronaczynia w kolbie.

Następnie umieść kolby w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby umożliwić przyleganie mikronaczyń do matrycy kolagen-fibronektyna.