Izolacja komórek mózgowych z larw danio pręgowanego: technika uzyskiwania nienaruszonych neuronów, makrofagów i mikrogleju z tkanki mózgowej danio pręgowanego

Mózg danio pręgowanego składa się z neuronów - komórek nerwowych, które odgrywają znaczącą rolę w przetwarzaniu informacji. Dodatkowo obejmuje populację wspierających komórek odpornościowych, w tym makrofagów i mikrogleju, które zamieszkują przestrzeń międzyneuronalną.

Aby wyizolować wszystkie te typy komórek mózgowych od danio pręgowanego, najpierw weź znieczulone larwy danio pręgowanego na szalce Petriego zawierającej odpowiednią pożywkę.

Wizualizuj danio pręgowanego pod mikroskopem stereoskopowym i przetransektuj głowy larw powyżej woreczka żółtkowego, aby utrzymać mózg w stanie nienaruszonym.

Przenieść wycięte głowy do homogenizatora wypełnionego wstępnie schłodzonymi podłożami, umieszczonego na lodzie. Niska temperatura pomaga zapobiegać degradacji komórek mózgowych.

Za pomocą tłuczka zhomogenizuj tkankę mózgową danio pręgowanego. Homogenizacja dezintegruje macierz zewnątrzkomórkową i inicjuje dysocjację neuronów, makrofagów i mikrogleju od tkanki mózgowej.

Ten etap oddziela również mielinę - warstwę izolacyjną bogatą w lipidy - od neuronów.

Przepuść homogenat przez sitko, aby zatrzymać duże grudki komórek.

Odwirować filtrat w celu granulacji komórek i fragmentów osłonki mielinowej. Usunąć supernatant zawierający szczątki.

Ponownie zawiesić osad w podłożu o odpowiednim gradiencie gęstości i pokryć go buforem.

Zakręć rurką z małą prędkością. Lżejsze fragmenty mieliny tworzą wyraźne pasmo na granicy pożywki buforowej i gradientu gęstości, podczas gdy gęstsze komórki osiadają na dole.

Odessać górne warstwy i ponownie zawiesić komórki mózgowe w świeżym podłożu do dalszego wykorzystania.

Dodaj 1,5 mililitra 15-milimolowej trikainy na 50 mililitrów pożywki do 50 larw w celu przygotowania znieczulenia. Następnie użyj 3-mililitrowej pipety Pasteura, aby przenieść 10 larw na raz na 55-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną lodowatą pożywką E3 z Trikainą, aby je ostatecznie znieczulić.

Pod mikroskopem stereoskopowym ustaw 10 larw w środku szalki Petriego. Następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych przeciąć główki larw powyżej woreczka żółtkowego.

Za pomocą 3-mililitrowej pipety Pasteura zbierz wszystkie głowy i przy jak najmniejszej ilości płynu przenieś je do szklanego homogenizatora na lodzie zawierającym 1 mililitr lodowatego podłoża A.

Wymieniać każdą małą szalkę Petriego zawierającą lodowatą pożywkę E3 i Trikaine na nową co 30 minut, aby upewnić się, że transsekcja jest przeprowadzana w zimnym podłożu E3 plus Trikaine.

Wymień lodowaty nośnik A w szklanym homogenizatorze, gdy kolor zacznie blaknąć. Po zebraniu całej grupy głów usuń całą pożywkę A ze szklanego homogenizatora i zastąp ją 1 mililitrem świeżej, lodowatej pożywki A.

Gdy homogenizator nadal znajduje się na lodzie, użyj ciasno dopasowanego tłuczka, aby rozbić tkankę mózgową, wykonując 40 rund miażdżenia i obracania dla 3 do 5 larw dpf i 50 rund dla larw 7 i 8 dpf.

Następnie dodaj 2 mililitry pożywki A do zawiesiny komórek, aby rozcieńczyć komórki i zmniejszyć ich aglomerację mieliną. Wyeliminuj aglomerację komórek, przepuszczając zawiesinę komórek przez 40-mikronowe sitko do zimnej 50-mililitrowej rurki sokoła na lodzie. Powtórz ten krok trzy razy.

Przenieś 1 mililitr podwielokrotności zawiesiny komórek do zimnych 1,5-milimetrowych probówek i wiruj je w temperaturze 300 x g i 4 stopnie Celsjusza przez 10 minut. Następnie, za pomocą 10-mililitrowej strzykawki z igłą 23G x 1", usuń supernatant.

Za pomocą 1 mililitra lodowatego podłoża o gradiencie gęstości 22%, delikatnie nałożonego na 0,5 mililitra lodowatego 1x DPBS, delikatnie ponownie zawieś osad ogniwa. Wiruj rurki z prędkością 950 x g bez przerwy i powolnego przyspieszania w 4 stopniach Celsjusza przez 30 minut.

Po wirowaniu wyrzuć pożywkę gradientu gęstości DPBS i mielinę uwięzioną na interfejsie. Następnie użyj 0,5 milimetra pożywki A z 2% NGS do umycia komórek i wiruj probówki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Usuń jak najwięcej supernatantu, a następnie wyciągnij granulki komórek z tych samych warunków eksperymentalnych razem w 1 mililitrze pożywki A z 2% NGS.

Jeśli interesujące komórki wyrażają białko fluorescencyjne, przepuść zawiesinę komórkową przez 35-mikronową nasadkę sitka komórkowego i przenieś je do zimnych 5-mililitrowych probówek FACS na lodzie chronionym przed światłem.