Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych (iNSC) z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC): procedura oparta na wirusie Sendai w celu przeprogramowania PBMNC na iNSC

Aby przeprogramować komórki somatyczne w indukowane nerwowe komórki macierzyste lub iNSC - komórki macierzyste o wysokiej zdolności do samoodnawiania i różnicowania, zacznij od hodowli komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w podłożu wolnym od surowicy w celu ekspansji erytroblastów.

Następnie odpipetować zawiesinę erytroblastów do płytki hodowlanej. Potraktuj komórki rekombinowanym wirusem Sendai lub SeV. Wirusy te kodują czynniki transkrypcyjne przeprogramowywane. Odwirować w celu osadzenia komórek i inkubacji.

Po fuzji SeV z błoną komórkową gospodarza genom wirusa ulega transkrypcji, a następnie translacji w cytoplazmie. Ektopowa ekspresja czynników transkrypcyjnych wyzwala proces przeprogramowania komórki bez integracji genów z genomem gospodarza.

Teraz odwiruj kulturę, aby usunąć wirusy. Ponownie zawiesić transdukowane komórki w odpowiednim podłożu, a następnie posiewać je. Ponadto odwiruj, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe. Zawieś ponownie komórki na nośniku iNSC.

Następnie zasiej komórki na płytce pokrytej białkiem. Komórki przyczepiają się do powłoki białkowej w płytce. Uzupełnij przylegające komórki pożywką iNSC co drugi dzień. Po tygodniu hodowli należy codziennie zastępować zużyte pożywki świeżymi pożywkami iNSC.

Czynniki wzrostu i składniki chemiczne w pożywkach utrzymują samoodnowę i wspierają pluripotencję podzbioru transdukowanych komórek, przeprogramowując je całkowicie do iNSC. Z biegiem czasu komórki zaczynają tworzyć kolonie iNSC. Wybierz żądane kolonie do hodowli.

W dniu 0 zbierz komórki w pożywce MNC i przenieś do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Po odwirowaniu komórek przy 200 x g przez 5 minut, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki 1 mililitrem wstępnie podgrzanego podłoża MNC. Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego, a następnie ponownie zawieś je za pomocą wstępnie podgrzanej pożywki MNC do stężenia 200 000 komórek na studzienkę na płytkach 24-dołkowych.

Rozmrozić probówki wyjęte z magazynu o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza zawierające wirusa Sendai w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 5 do 10 sekund, a następnie pozostawić je do rozmrożenia w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu umieść je natychmiast na lodzie. Dodaj rozmrożonego wirusa Sendai do studzienek 24-dołkowej płytki z MNC przy wielokrotności infekcji 10. Aby ułatwić przyczepianie komórek, odwiruj płytki o wymiarach 1,000 x g przez 30 minut, a następnie umieść płytki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla.

W dniu 1 przenieś komórki z pożywką do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Aby jeszcze bardziej odłączyć pozostałe komórki, przepłucz studzienki 1 mililitrem pożywki MNC na studzienkę i dodaj komórki z pożywką do probówki. Po odwirowaniu tej zawiesiny komórkowej o masie 200 x g przez 5 minut, odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki za pomocą 500 mikrolitrów świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki MNC i dodać do dołka na 24-dołkowej płytce.

W dniu 2 użyj 1 mililitra na studzienkę wcześniej rozcieńczonych 50 mikrogramów na mikrolitr poli-D-lizyny i D-PBS do powlekania 6-dołkowych płytek przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej. Odessać poli-D-lizynę z płytek 6-dołkowych i suszyć na pionowej czystej ławce przez około 10 minut. Następnie dodaj 1 mililitr na dołek wcześniej rozcieńczonej 5 mikrogramów na mililitr lamininy do płytek 6-dołkowych i inkubuj przez 4 do 6 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu pokrycia. Przed użyciem umyj płytki preparatem D-PBS.

W dniu 3 wszystkie wirusy Sendai transdukowały MNC w indukowanym pożywce nerwowych komórek macierzystych na 6-dołkowych płytkach pokrytych lamininą poli-D-lizyną. W dniach 5 i 7 delikatnie dodaj 1 mililitr wstępnie podgrzanej pożywki iNSC o temperaturze 37 stopni Celsjusza do każdej studzienki z 6-dołkowych płytek.

Od 9 do 28 dnia codziennie zastępuj pożywkę świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką iNSC. Monitoruj pojawianie się kolonii iNSC, a po około 2 do 3 tygodniach wybierz kolonie o odpowiedniej morfologii za pomocą spalonych szklanych pipet. Następnie przenieś każdą kolonię do oddzielnego dołka na 6-dołkowej płytce w celu ekspansji.