JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 4:07 min. • July 8th, 2025
Kropelkowa cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy lub technologia dPCR dzieli reagenty pojedynczej reakcji PCR na miliony reakcji PCR z nanokropelkami. To masowe partycjonowanie, po którym następuje amplifikacja, wykrywa niewielką ilość zmutowanego DNA na dużym tle DNA typu dzikiego, umożliwiając wczesne wykrycie raka.
Na początek odessaj główną mieszankę dPCR zawierającą znakowane fluorescencyjnie oligonukleotydy wraz z innymi odczynnikami PCR i olejem stabilizującym kropelki. Dodaj tę mieszankę główną bezpośrednio na dno każdej studzienki w probówce paskowej PCR, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Następnie dodaj próbki DNA do mieszaniny reakcyjnej i kilkakrotnie pipetuj w celu wymieszania.
Teraz przenieś całą mieszaninę reakcyjną do specjalistycznego chipa przyrządu generującego kropelki. Zamontuj świeżą probówkę z paskiem PCR na przyrządzie do generowania kropel. Generator kropel łączy próbkę i olej, tworząc dyskretne nanokropelki z zamkniętym obszarem, który zapobiega zanieczyszczeniu krzyżowemu między kropelkami.
Po zakończeniu kropelkowania przenieś probówkę paskową PCR do termocyklera w celu amplifikacji docelowego DNA. Następnie załaduj produkt PCR do czytnika kropelek zawierającego detektor fluorescencyjny, który zlicza fluorescencyjne kropelki dodatnie i ujemne. Liczba dodatnich kropel może być wykorzystana do obliczenia docelowego stężenia DNA w próbce.
Przed rozpoczęciem procedury kropelkowego cyfrowego PCR należy oczyścić przestrzeń stołu i sprzęt 10% wybielaczem i 70% etanolem, a następnie delikatnie odwirować i krótko odwirować wszystkie odczynniki z wyjątkiem oleju stabilizującego kropelki. Upewnij się, że butla ze sprężonym azotem jest podłączona do przyrządu wytwarzającego kropelki i że zbiornik butli jest ustawiony na 90 funtów na cal kwadratowy. Dodaj 38 mikrolitrów cyfrowej mieszaniny reakcyjnej PCR bezpośrednio na dno każdego dołka 8-dołkowego paska probówki do PCR, usuwając wszelkie pęcherzyki za pomocą czystej końcówki pipety.
Dodać 12 mikrolitrów wstępnie amplifikowanej próbki DNA w trzech egzemplarzach do odpowiednich dołków paska probówki. Delikatnie odpipetować pełną objętość 10 razy, aby wymieszać mieszaninę reakcyjną z próbką DNA i odpipetować pełną objętość z każdej studzienki do odpowiednich kanałów od A do H chipa przyrządu wytwarzającego kropelki. Włożyć nowy pasek probówki do PCR do urządzenia do generowania kropel i zeskanować identyfikator chipa przyrządu do generowania kropel do oprogramowania na komputerze instrumentu.
Następnie kliknij "Rozpocznij bieg", aby rozpocząć kropelowanie próbek. Po zakończeniu kropelowania usuń pasek probówki do PCR i nałóż nakrętki z probówką. Przenieś pasek rurki do termocyklera i zrównoważ rurkę z innym paskiem probówki zawierającym 80 mikrolitrów wody na studzienkę. Następnie uruchom termocykler w odpowiednich warunkach cykli termicznych. Wymień nasadki pasków na nasadki szybkoobrotowe.
Po zakończeniu cykli termicznych przenieś pasek rurki do przyrządu do oznaczania ilościowego. Kliknij "Ustaw przebieg" w oprogramowaniu urządzenia i umieść pasek rurki w urządzeniu do oznaczania ilościowego. Umieść metalową osłonę na nowym chipie przyrządu do pomiaru ilościowego. Zeskanuj identyfikator chipa do urządzenia i włóż chip do urządzenia. Zamknij pokrywę instrumentu. W oprogramowaniu komputerowym wprowadź nazwę przebiegu cyfrowego PCR i każdego z ośmiu kanałów. Następnie wybierz "Tryb szybki" i kliknij "Start", aby rozpocząć kwantyfikację.