JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 4:15 min. • July 8th, 2025
Komórki macierzyste guza mózgu lub BTSC, subpopulacja komórek guza mózgu, mogą inicjować wzrost guza i przerzuty, co czyni je obiecującymi celami terapii raka. Aby zbadać wpływ leków na migrację BTSC in vitro, należy najpierw przygotować jednolite zawiesiny BTSC w odpowiednim podłożu. Leczyć jedną z zawiesin lekiem będącym przedmiotem zainteresowania.
W międzyczasie uzyskaj wielodołkową płytkę chemotaksji składającą się z błoniastych wkładek, które rozdzielają każdą studzienkę na górną i dolną komorę. Pipeta pożądała białko macierzy zewnątrzkomórkowej do dolnych komór i wkładek błoniastych. Inkubować w celu ułatwienia polimeryzacji białka.
Dodać odpowiednią pożywkę podstawową zawierającą pożądany chemoatraktant do dolnych komór i umieścić na błoniastych wkładkach. Następnie wysiewaj potraktowaną lekiem i nietraktowaną zawiesinę BTSC do błoniastych wkładek. Obrazuj płytkę przez dłuższy czas za pomocą mikroskopii żywych komórek.
W hodowli BTSC przylegają do matrycy białkowej wkładki. W odpowiedzi na gradient stężenia chemoatraktantu ustalony między górną i dolną komorą, nieleczone BTSC migrują przez matrycę białkową przez pory wkładki błonowej do dolnej komory.
Jednak leczenie farmakologiczne negatywnie wpływa na aktywność funkcjonalną komórek, zmniejszając migrację BTSC. Teraz, za pomocą odpowiedniego oprogramowania, przeanalizuj i określ ilościowo migrowane BTSC w dolnych komorach. Nieleczone BTSC wykazują zwiększoną migrację, podczas gdy BTSC leczone farmakologicznie wykazują zmniejszoną migrację.
Aby ocenić wpływ leczenia farmakologicznego będącego przedmiotem zainteresowania na migrację, należy najpierw wstępnie potraktować komórki odpowiednim stężeniem leku przez odpowiedni okres eksperymentalny. Aby przygotować płytkę chemotaksji, pokryj trzy studzienki z wkładką membranową i trzy studzienki dolnego zbiornika na warunek 96-dołkowej płytki chemotaksji odpowiednio 75 i 225 mikrolitrów 0,2 miligrama na mililitr kolagenu typu I przez 1 godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Pod koniec inkubacji odessać roztwór kolagenu z każdej studzienki bez rysowania powłoki kolagenowej i przemyć studzienki dwa razy sterylnym PBS. Po ostatnim myciu wyjmij wkładkę z płytki i dodaj 225 mikrolitrów pożywki wolnej od czynnika wzrostu uzupełnionej 10% FBS do każdej studzienki dolnego zbiornika płytki chemotaksji.
Następnie delikatnie włóż górną wkładkę do dolnego zbiornika pod kątem, aby uniknąć tworzenia pęcherzyków i dodaj 2,5 razy 10 do trzecich zdysocjowanych BTSC w 50 mikrolitrach pożywki wolnej od czynnika wzrostu do każdej studzienki. Ważne jest, aby całkowicie rozdzielić BTSC na pojedyncze komórki i dokładnie je policzyć przed posiewem, aby uniknąć grudek komórek lub zbyt wielu komórek w górnej wkładce.
Aby zobrazować migrację BTSC wzdłuż gradientu FBS, umieść płytkę w systemie obrazowania żywych komórek i ustaw automatyczne oprogramowanie do obrazowania tak, aby uzyskiwało mikroskopowe obrazy płytki co 1 do 2 godzin przez okres do 72 godzin. Po zakończeniu akwizycji obrazu wybierz nową definicję przetwarzania, aby odróżnić BTSC od ich porów wstawienia na dolnej stronie membrany, modyfikując analizę, jeśli nie odróżnia ona dokładnie komórek od błony tła, jak to konieczne.
Aby określić ilościowo komórki, które migrowały przez pory, zbierz dane jako powierzchnię komórki na dolnej stronie błony dla każdej z trzech studzienek replikowanych w danym warunku. Następnie narysuj wykres migracji komórek jako obszar migrujących komórek w mikrometrach do kwadratu w czasie.