JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 4:32 min. • July 8th, 2025
Komórki macierzyste guza mózgu lub BTSC - podzbiór komórek w guzach mózgu - posiadają zdolności do samoodnawiania się i przyczyniają się do progresji guza i oporności na terapię. Aby określić wpływ leków na inwazję BTSC in vitro, należy rozpocząć od zawiesin BTSC w odpowiednim podłożu w kolbach hodowlanych. Leczyć jedną z zawiesin lekiem będącym przedmiotem zainteresowania.
Inkubować kolby. Składniki pożywki sprzyjają proliferacji komórek. Komórki pozostają w zawieszeniu, tworząc w ten sposób kuliste skupiska zwane neurosferami. Po osiągnięciu pożądanego rozmiaru zbierz neurosfery. Pozwól im osadzać się grawitacyjnie i usuń media. Następnie ponownie zamieszaj nieleczone i leczone lekami neurosfery w schłodzonym pożywce zawierającej odpowiednie białko macierzy zewnątrzkomórkowej i lek.
Zawiesiny umieścić w schłodzonej płytce wielodołkowej. Pozwól neurosferom osiąść na dnie studni, aby uzyskać lepsze obrazowanie. Następnie inkubuj w celu polimeryzacji białek macierzy, osadzając w nich neurosfery. Obrazuj neurosfery przez dłuższy czas za pomocą mikroskopii żywych komórek. W hodowli osadzone BTSC wydzielają enzymy proteolityczne, które degradują białka macierzy, umożliwiając migrację komórek.
Z biegiem czasu zwiększona degradacja macierzy tworzy odpowiednie mikrośrodowisko dla inwazji BTSC z neurosfer do otaczającej macierzy. Za pomocą odpowiedniego oprogramowania zmierz całkowitą powierzchnię neurosfer w różnych punktach czasowych. Nieleczone BTSC wykazują zwiększoną powierzchnię, co wskazuje na zwiększony wskaźnik inwazji niż BTSC leczone lekiem.
Aby ocenić inwazję neurosfery BTSC, najpierw dodaj interesujący związek do kolby o pożądanym stężeniu dla z góry określonego czasu przed posiewem inwazji neurosfery. Gdy średni rozmiar neurosfery osiągnie około 150 do 200 mikrometrów, przechyl i delikatnie wymieszaj kolbę pipetą, a następnie przenieś 500 mikrolitrów zawieszonych neurosfer BTSC do jednej 1,5-mililitrowej probówki na warunki eksperymentalne na lodzie.
Odessać jak najwięcej pożywki z dna każdej 1,5-mililitrowej probówki bez utraty osadu neurosfery i delikatnie ponownie zawiesić neurosfery w 500 mikrolitrach świeżo przygotowanego roztworu kolagenu typu I o grubości 0,4 miligrama na mililitr. Przenieś 100 mikrolitrów neurosfer zawieszonych w kolagenie do trzech dołków na warunek na nową 96-dołkową płytkę na lodzie i pozwól neurosferom osiąść na 5 minut.
Bardzo ważne jest, aby pozwolić neurosferom osiąść na lodzie na 5 minut. W przeciwnym razie sfery nie będą znajdować się na tej samej płaszczyźnie ostrości dla obrazowania. Po 5 minutach polimeryzacji kolagenu w inkubatorze do hodowli komórkowych przenieś płytkę do tacki systemu obrazowania żywych komórek, aby uzyskać referencyjny obraz wielkości neurosfery w momencie posiewu przed rozpoczęciem inwazji. Następnie ustaw oprogramowanie tak, aby pobierało obrazy co 1 do 2 godzin, aż szybkość inwazji ustabilizuje się, zwykle o 24 godziny.
Aby zobrazować zwiększającą się powierzchnię BTSC w miarę jak z czasem atakują matrycę, użyj obiektywu 10x, aby uzyskać cztery obrazy na studzienkę dla każdego zestawu trzech powtórzonych dołków. Aby określić względną powierzchnię komórki reprezentowaną jako procentowa zbieżność studzienki, należy skonfigurować definicję przetwarzania, która wyraźnie wyróżnia komórki na tle studni. Następnie zbierz dane jako całkowitą powierzchnię komórki dla każdej studzienki w każdym punkcie czasowym. Określ średnią z trzech dołków replikacji i narysuj na wykresie inwazję BTSC, wykreślając rosnącą powierzchnię komórki w czasie.