JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 4:13 min. • July 8th, 2025
Glejak wielopostaciowy posiada komórki macierzyste, które migrują wzdłuż dróg aksonalnych mielinizowanych neuronów, aby zaatakować odległe miejsca w mózgu. Aby podsumować migrację komórek glejaka lub GBM na neurony in vitro, zacznij od pobrania szklanego szkiełka nakrywkowego.
Aktywuj szkiełko nakrywkowe za pomocą plazmy tlenowej i zagruntuj je środkiem funkcjonalnym. Zabieg ten zapewnia łatwy dostęp do substancji chemicznych w kolejnych etapach. Dodać roztwór PEGylowany do szkiełka nakrywkowego i inkubować. Roztwór ten pokrywa szkiełko nakrywkowe, zapobiegając zrostowi neuronów w losowych miejscach.
Naniec polimer fotoinicjatora na szkiełko nakrywkowe i zamontuj go w komorze obrazowania. Umieść komorę na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. Po wejściu do środka oświetlenie UV aktywuje cząsteczki fotoinicjatora lokalnie w wyznaczonych obszarach odpowiadających przewidywanym mikrowzorcom.
Aktywowane cząsteczki fotoinicjatora rozszczepiają leżącą pod spodem warstwę PEG, generując pożądany wzór. Teraz dodaj roztwór lamininy i inkubuj. Laminina - glikoproteina - osadza się w określonych miejscach, w których została usunięta warstwa PEG. Wysiewaj pożywkę zawierającą neurony hipokampa szczura na szkiełku nakrywkowym.
Inkubować, aby umożliwić przyleganie neuronów do matryc pokrytych lamininą, aby uzyskać szkiełka nakrywkowe z mikrowzorami neuronów. Umieść zawiesinę znakowanych fluorescencyjnie komórek GBM na neuronach z mikrowzorami. Obraz, aby zobaczyć fluorescencyjne komórki GBM migrujące na neuronach.
Aby zrobić podłoże do mikromodelowania, należy traktować 18-milimetrowe okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe aktywacją powietrzną lub plazmową przez 5 minut przed umieszczeniem szkiełek nakrywkowych w eksykatorze ze 100 mikrolitrami 3-aminopropylotrietoksysilanu na 1 godzinę. Następnie inkubować roztwór Peg-SVA w stężeniu 100 miligramów na mililitr przez 1 godzinę w celu osadzania żelu. Pod koniec inkubacji dodaj 3 mikrolitry PLPP i 50 mikrolitrów absolutnego etanolu na środek szkiełka i poczekaj, aż całkowicie wyschnie.
W celu wykonania mikrowzoru szkiełka nakrywkowego należy zamontować szkiełko nakrywkowe w komorze Ludina i umieścić komorę na stoliku mikroskopu wyposażonym w system automatycznego ustawiania ostrości. Po zobrazowaniu załaduj obrazy z mikrowzorami do oprogramowania. Po automatycznym sekwencjonowaniu w świetle UV za pomocą pipety dokładnie zmyj PLPP z szkiełka nakrywkowego za pomocą PBS. Następnie inkubować szkiełko nakrywkowe z 50 mikrogramami na mililitr lamininy przez 30 minut, a następnie ponownie przemyć PBS, jak pokazano.
Aby założyć embrionalną hodowlę neuronów hipokampa szczura na mikrowzorzystych szkiełkach nakrywkowych, po ostatnim myciu należy ponownie nawodnić szkiełka pożywką do hodowli komórek neuronalnych. Wysiew 5 razy 10 do czwartego neuronów hipokampa szczura zawieszonych w podłożu neurobazalnym wzbogaconym o 3% surowicy końskiej na centymetr kwadratowy na każdym mikrowzorzystym szkiełku nakrywkowym na 24-godzinną inkubację w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odwirować zdysocjowane komórki glejaka przez 5 minut z prędkością 1,000 obr./min i ponownie zawiesić osad w pożywce do hodowli komórek glejaka. Następnie umieść 1 razy 10 do trzecich komórek GBM nad neuronami z mikrowzorami.