JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 4:21 min • July 8th, 2025
W ośrodkowym układzie nerwowym perycyty są wielofunkcyjnymi komórkami, które otaczają komórki śródbłonka, które tworzą wewnętrzną wyściółkę komórkową naczyń włosowatych. Perycyty pomagają regulować przepływ krwi i utrzymywać homeostazę mózgu.
Aby wyizolować perycyty, zacznij od pobrania zamrożonych naczyń włosowatych mózgu bydlęcego w fiolce. Po rozmrożeniu przenieś zawartość do probówki zawierającej żądane podłoże. Wirówka do granulowania naczyń włosowatych. Usunąć sklarowany sklarent zawierający pożywkę zamrażającą. Zawiesić osad kapilarny w pożywce i zasiać zawiesinę do kolby pokrytej białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej.
Inkubować, aby naczynia włosowate przylegały do powłoki w kolbie. Zastąp pożywkę pożywką zawierającą heparynę. W hodowli powłoka białkowa macierzy zewnątrzkomórkowej sprzyja migracji perycytów z fragmentów naczyń włosowatych i proliferacji, podczas gdy heparyna stymuluje migrację komórek śródbłonka.
Zastąp zużyte podłoże pożywką zawierającą heparynę. Z biegiem czasu perycyty wystają wydłużone wyrostki, które silnie przylegają do kolby. Przy ograniczonej przestrzeni substratu komórki śródbłonka namnażają się i tworzą monowarstwę hamowaną kontaktowo. Po osiągnięciu odpowiedniej gęstości perycytów należy usunąć podłoże i przemyć kolbę buforem.
Użyj trypsyny-EDTA, aby odłączyć luźno związane komórki śródbłonka od kolby. Następnie dodaj pożywkę, aby zneutralizować aktywność trypsyny-EDTA. Kilkakrotnie przemyć pożywką, aby usunąć oderwane komórki śródbłonka. Dodać pożywkę i upewnić się, że perycyty pozostają połączone z kolbą. Inkubuj kulturę wzbogaconą w perycyty, aby się rozmnażać.
Zacznij od rozmrożenia jednej fiolki naczyń włosowatych w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po rozmrożeniu kapilar przenieś je do probówki wirówkowej z 30 mililitrami DMEM-comp i odwiruj je przez 5 minut przy 500 x g. Następnie usuń pożywkę z probówki i ponownie zawieś osad w 10 mililitrach świeżego DMEM-comp. Przenieść zawiesinę do powlekanej kolby T75 i pozostawić kapilary do przylegania do dna przez 4 do 6 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza zasilanym 10% dwutlenkiem węgla. Po inkubacji sprawdzić kolbę pod mikroskopem świetlnym.
Frakcje naczyń włosowatych należy teraz przymocować do dna kolby. W 4 dniu, po wysianiu naczyń włosowatych, sprawdź je pod mikroskopem, aby upewnić się, że zlewają się w około 60% do 70%. Odessać pożywkę i delikatnie przemyć komórki PBS. Dodać 2 mililitry rozmrożonej trypsyny-EDTA i pozostawić kolbę w inkubatorze na 1 do 3 minut, często wyjmując kolbę i obserwując odłączanie komórek pod mikroskopem. Kiedy komórki śródbłonka zaczną się zaokrąglać, delikatnie postukaj w kolbę, aby je odłączyć.
Gdy komórki się odłączą, przerwij trypsynizację, dodając 10 mililitrów DMEM-comp do kolby. Przepłukać kolbę kilkakrotnie pożywką i odessać zawiesinę komórek śródbłonka, która może być teraz wykorzystana do innych celów. Dodaj 10 mililitrów DMEM-comp do kolby i sprawdź ją pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że perycyty są nadal obecne i przyczepione do dna. Następnie umieść kolbę z powrotem w inkubatorze, aby umożliwić wzrost kultury wzbogaconej o perycyty.
Niniejszy artykuł omawia izolację i hodowlę perycytów z kapilar mózgowych bydła. Perycyty odgrywają kluczową rolę w regulacji przepływu krwi oraz utrzymaniu homeostazy mózgu.
Niezawodna izolacja i hodowla pierwotnych pericytów mózgu bez zanieczyszczeń śródbłonkowych odpowiada na krytyczną potrzebę tworzenia istotnych dla przebiegu chorób modeli in vitro w badaniach naczyniowo-nerwowych. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania oraz w walidacji celów terapeutycznych w rozwoju leków na ośrodkowy układ nerwowy. Metoda ta wspiera ciągłość translacyjną, umożliwiając badania mechanistyczne nad funkcją pericytów i oddziaływaniami naczyniowo-nerwowymi.
Ta metoda izolacji perycytów znajduje zastosowanie na styku wczesnych etapów odkryć i rozwoju modeli przedklinicznych, stanowiąc podstawę dla późniejszych badań przesiewowych i analiz mechanistycznych.
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 22 sierpnia 2026