Izolacja naczyń włosowatych mózgu od ludzkiego mózgu: zoptymalizowana metoda ekstrakcji naczyń włosowatych mózgu z ludzkiej tkanki mózgowej

Naczynia włosowate mózgu są istotnym elementem bariery krew-mózg - półprzepuszczalnej bariery, która umożliwia selektywny ruch substancji rozpuszczonych między krwią a mózgiem. Aby wyizolować naczynia włosowate mózgu, zacznij od świeżej ludzkiej tkanki mózgowej. Usuń opony mózgowe i odetnij białą masę.

Zmiel tkankę mózgową na mniejsze fragmenty. Przenieść fragmenty do homogenizatora zawierającego odpowiedni bufor i homogenizować. Homogenizacja powoduje rozpad tkanek, uwalniając naczynia włosowate i resztki tkanek do roztworu.

Przenieść homogenat do świeżej probówki i dodać optymalną objętość pożywki o odpowiednim gradiencie gęstości. Odwirować roztwór, aby osadzać naczynia włosowate. Zbyt duża lub zbyt mała pożywka o gradiencie gęstości powoduje niską wydajność kapilarną. Usunąć supernatant.

Zawiesić osad w albuminie surowicy bydlęcej lub buforze uzupełnionym BSA. BSA stabilizuje enzymy trawienne i utrzymuje integralność strukturalną naczyń włosowatych. Następnie przefiltruj roztwór odpowiednim filtrem, aby usunąć duże naczynia i resztki tkanek.

Następnie przepuść filtrat przez mniejszy filtr siatkowy. Filtr ten zatrzymuje naczynia włosowate mózgu i przepuszcza mniejsze zanieczyszczenia i czerwone krwinki. Następnie odwróć filtr i zmyj naczynia włosowate w świeżej probówce z buforem uzupełnionym BSA.

Odwirować roztwór i usunąć supernatant. Zawiesić czyste naczynia włosowate w buforze i przechowywać je do dalszego wykorzystania.

Aby rozpocząć tę procedurę, udokumentuj wagę ludzkiej tkanki mózgowej, która powinna wynosić około 10 gramów. Pod mikroskopem ostrożnie usuń wszystkie opony mózgowe kleszczami i za pomocą skalpela odetnij istotę białą. Następnie ostrożnie pokrój tkankę mózgową i miel ją skalpelem przez około 5 minut.

Przenieś tkankę mózgową do młynka do tkanek i dodaj 30 mililitrów buforu izolacyjnego. Następnie homogenizować każdą próbkę za pomocą 100 uderzeń przy 50 obr./min. Nie mieszaj powietrza, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków. Udokumentuj czas co 25 uderzeń i całkowity czas potrzebny na 100 ruchów. Następnie przenieś homogenat do homogenizatora Dounce na lodzie. Homogenizować zawiesinę przez około 20 ruchów i unikać pęcherzyków.

Następnie rozprowadź równomiernie homogenat mózgu w czterech 50-mililitrowych probówkach wirówkowych i udokumentuj całkowitą objętość homogenatu. Upewnij się, że dodałeś odpowiednią objętość Ficollu. Zbyt mała lub zbyt duża ilość Ficollu spowoduje nieprawidłową gęstość do oddzielenia naczyń włosowatych od resztek komórkowych, a tym samym zmniejszy ilość osadu kapilarnego i ograniczy wydajność.

Użyj 10 mililitrów buforu izolacyjnego, aby przepłukać tłuczek i homogenizator i rozprowadzić je w czterech probówkach wirówkowych. Następnie rozprowadź 50 mililitrów buforu gradientu gęstości do probówek wirujących. Szczelnie zamknij probówki wirówkowe nakrętkami. Następnie wymieszać homogenat, pożywkę o gradiencie gęstości i buforować, energicznie potrząsając probówkami. Wirować przy 5 800 x g przez 15 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś każdą osadkę w 2 mililitrach 1% BSA.

Po ponownym wymieszaniu granulatu przefiltruj zawiesinę przez siatkę o średnicy 300 mikrometrów. Kapilary są filtrowane przez siatkę, podczas gdy większe naczynia i większe szczątki mózgu pozostają na siatce. Ostrożnie umyj siatkę do 50 mililitrów 1% BSA, a następnie wyrzuć siatkę. Aby oddzielić naczynia włosowate od czerwonych krwinek i innych resztek mózgu, rozprowadź filtrat kapilarny na filtrach szczepów komórkowych o średnicy 530 mikrometrów.

Naczynia włosowate są zatrzymywane przez ten filtr, podczas gdy czerwone krwinki, inne pojedyncze komórki i małe szczątki mózgu przechodzą przez filtr i są zbierane w filtracie. Następnie umyj każdy filtr 25 mililitrami 1% BSA. Wlej wszystkie filtraty na szósty filtr, aby zwiększyć wydajność. Umyj każdy filtr 50 mililitrami 1% BSA. Zachowaj filtry odkształceń komórkowych zawierające naczynia włosowate i wyrzuć filtrat. Następnie odwróć filtry do góry nogami i umyj naczynia włosowate 50 mililitrami 1% BSA do 50-mililitrowych probówek.

Delikatnie dociśnij końcówką pipety i przesuwaj ją po filtrze, aby zmyć naczynia włosowate mózgu. Upewnij się, że zmyłeś wszystkie naczynia włosowate mózgu, zwłaszcza z krawędzi filtra. Unikaj pęcherzyków, ponieważ utrudnia to proces filtracji i zwiększa ryzyko utraty naczyń włosowatych. Po zebraniu naczyń włosowatych odwirować wszystkie próbki o masie 1 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w około 3 mililitrach buforu izolacyjnego.

Następnie połącz wszystkie zawieszone granulki z jednej próbki w 15-mililitrowej stożkowej probówce i napełnij ją buforem izolacyjnym. Ponownie odwirować przy 1 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza i umyć jeszcze dwa razy. Udokumentuj czystość naczyń włosowatych za pomocą mikroskopu przy 100-krotnym powiększeniu i kamery. Izolowane naczynia włosowate mózgu mogą być teraz wykorzystywane do eksperymentów, przetwarzane lub zamrażane błyskawicznie i przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w krioprobówkach przez co najmniej 6 do 12 miesięcy.