JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:05 min. • July 8th, 2025
Zymografia to technika elektroforetyczna, która polega na kopolimeryzacji substratu białkowego z żelem poliakrylamidowym w celu wykrycia enzymów hydrolitycznych i ich aktywności. Na początek rozpuść próbki w buforze zymgraficznym zawierającym glicerol, dodecylosiarczan sodu lub SDS i błękit bromofenolowy.
Glicerol sprawia, że bufor próbki jest gęstszy niż otaczający go bufor biegnący żelu, co umożliwia łatwe ładowanie do kieszeni żelowych. SDS - anionowy detergent - denaturuje enzymy w próbce i pokrywa je ładunkiem ujemnym. Błękit bromofenolowy - barwnik śledzący - pomaga monitorować postęp próbki w żelu.
Załaduj próbki w żelu poliakrylamidowym osadzonym w substratach fluorogennych w celu wykrycia aktywności proteazy. Teraz podłącz elektrody i rozpocznij elektroforezę. Wytworzone pole elektryczne powoduje, że wszystkie enzymy związane z SDS migrują przez żel w kierunku dodatnio naładowanej elektrody.
Po zakończeniu elektroforezy należy usunąć żel i umyć go w buforze do renaturyzacji zawierającym niejonowy detergent, który wypiera SDS, aby umożliwić renaturację enzymów. Następnie inkubuj żel w rozwijającym się buforze zawierającym kationy dwuwartościowe, które aktywują enzymy w żelu.
Aktywne proteazy rozszczepiają substraty fluorogenne, powodując wzrost fluorescencji. Zobrazuj żel, aby zaobserwować fluorescencyjne prążki białkowe, których intensywność jest proporcjonalna do aktywności proteazy.
Aby rozpocząć, rozpuść próbki w konwencjonalnym buforze próbek zymografii. Dodaj 400 mililitrów 1x buforu do biegania Tris-Glycine SDS do aparatu żelowego. Załaduj do 35 mikrolitrów próbki na studzienkę. Próbki należy badać pod napięciem 120 V w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 1,5 godziny lub do momentu, gdy wzorce masy cząsteczkowej wskażą, że interesujące proteazy znajdują się w warstwie żelu rozdzielczego peptydów. Następnie wyjmij żele z plastikowej kasety.
Umyć żele trzykrotnie w buforze do renaturyzacji w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem, przy czym każde płukanie trwa 10 minut. Przenieść żele do rozwijającego się roztworu buforowego na 15 minut. Następnie zastąp roztwór świeżym buforem do rozwijania się i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod delikatnym mieszaniem przez 24 godziny. Następnie należy użyć skanera/imagera do żelu fluorescencyjnego z odpowiednimi filtrami wzbudzenia i emisji, aby zobrazować żele.