Fluorescencyjna zymografia peptydów: zmodyfikowana technika wykrywania aktywności proteazy za pomocą substratów fluorogennych w żelach zymogramowych

Zymografia to technika elektroforetyczna, która polega na kopolimeryzacji substratu białkowego z żelem poliakrylamidowym w celu wykrycia enzymów hydrolitycznych i ich aktywności. Na początek rozpuść próbki w buforze zymgraficznym zawierającym glicerol, dodecylosiarczan sodu lub SDS i błękit bromofenolowy.

Glicerol sprawia, że bufor próbki jest gęstszy niż otaczający go bufor biegnący żelu, co umożliwia łatwe ładowanie do kieszeni żelowych. SDS - anionowy detergent - denaturuje enzymy w próbce i pokrywa je ładunkiem ujemnym. Błękit bromofenolowy - barwnik śledzący - pomaga monitorować postęp próbki w żelu.

Załaduj próbki w żelu poliakrylamidowym osadzonym w substratach fluorogennych w celu wykrycia aktywności proteazy. Teraz podłącz elektrody i rozpocznij elektroforezę. Wytworzone pole elektryczne powoduje, że wszystkie enzymy związane z SDS migrują przez żel w kierunku dodatnio naładowanej elektrody.

Po zakończeniu elektroforezy należy usunąć żel i umyć go w buforze do renaturyzacji zawierającym niejonowy detergent, który wypiera SDS, aby umożliwić renaturację enzymów. Następnie inkubuj żel w rozwijającym się buforze zawierającym kationy dwuwartościowe, które aktywują enzymy w żelu