JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 5:19 min • July 8th, 2025
Zacznij od pobrania ciężarnej, znieczulonej samicy myszy umieszczonej w pozycji leżącej. Przygotuj mysz, usuwając włosy z okolicy brzucha. Naciąć skórę i leżące pod nią warstwy mięśni, aby odsłonić rogi macicy - miejsca, w których znajdują się zdolne do życia zarodki.
Teraz wyciągnij rogi macicy z jamy brzusznej. Weź szklaną kapilarnę z ostrą końcówką zawierającą pożądany roztwór plazmidowego DNA. Zlokalizuj mózg zarodka i wstrzyknij roztwór plazmidowego DNA przez ścianę macicy do czwartej komory. Ta pozycja jest przed zawiązkiem móżdżku - pożądanym miejscem do ewentualnego dostarczenia DNA.
Po wstrzyknięciu należy cofnąć pustą kapilarę. Następnie, w celu elektroporacji zarodka, któremu wstrzyknięto DNA, umieść dwie elektrody nad ścianą macicy tak, aby elektroda dodatnia zakrywała zawiązek móżdżku, a elektroda ujemna obszar wokół uszu.
Zastosuj impulsy elektryczne przez żądany czas. Impulsy te sprawiają, że komórki neuronalne móżdżku stają się przepuszczalne, umożliwiając plazmidowemu DNA wniknięcie do docelowych komórek. Na koniec umieść rogi macicy z powrotem w jamie brzusznej w ich naturalnej pozycji. Zszyj nacięcia, przenieś mysz do klatki i pozwól jej dojść do siebie.
Zacznij od załadowania kapilary ze szkła borokrzemianowego do ściągacza do mikropipet i pociągnięcia, aby uzyskać cienką końcówkę. Oznacz końcówkę kapilary czarnym tuszem, aby uzyskać lepszą wizualizację podczas wstrzykiwania i narysuj skalę na szkle. Pracując pod mikroskopem stereoskopowym, za pomocą linijki i ostrej pęsety igłowej przyciąć końcówkę na długość około 6 milimetrów i uzyskać ostrą, jednostronnie ściętą krawędź.
Przefiltruj 1% roztwór podstawowy Fast Green przez filtr 0,22 mikrona, aby usunąć cząsteczki barwnika z roztworu. Wymieszaj plazmidy RNA z pojedynczym przewodnikiem w równych częściach z plazmidem reporterowym lucyferazy do końcowego stężenia co najmniej 1 mikrograma na mililitr dla każdego plazmidu.
Pokoloruj roztwór osocza preparatem Fast Green o końcowym stężeniu 0,05%. Po znieczuleniu ciężarnej myszy CD-1 izofluranem, połóż mysz na plecach na poduszce grzewczej i podaj środek przeciwbólowy. Zastosuj maść do oczu, aby zapobiec suchości oczu podczas zabiegu. Przymocuj kończyny taśmą i wysterylizuj brzuch środkiem dezynfekującym.
Przykryj mysz gazą, pozostawiając odsłonięte tylko obszar chirurgiczny. Po wykonaniu nacięcia skóry o długości około 2 centymetrów zlokalizuj linea alba i użyj nożyczek do tkanek z końcówką, aby wykonać nieco mniejsze drugie nacięcie przez otrzewną. Zwilż otwartą jamę brzuszną wstępnie podgrzanym sterylnym PBS.
Następnie za pomocą kleszczy pierścieniowych ostrożnie wyciągnij rogi macicy z jamy brzusznej. Chwyć ścianę macicy w szczelinie między woreczkami żółtkowymi dwóch sąsiednich zarodków i delikatnie pociągnij. Unikaj wywierania nacisku na zarodek podczas przeciągania go przez nacięcie. Po usunięciu rogów macicy odessać około 10 do 15 mikrolitrów kolorowego roztworu plazmidu za pomocą przygotowanej szklanej kapilary. Podczas tego procesu unikaj pęcherzyków powietrza.
Delikatnie przytrzymaj zarodek kleszczami pierścieniowymi i zlokalizuj obszar szyi. Powoli penetruj grzbietową tyłomózgowie czubkiem szklanej naczynia włosowatego i przejdź do czwartej komory. Wstrzyknąć około 1 mikrolitra mieszanki plazmidów. Upewnij się, że zabarwione DNA nie wyciekło z mózgu i jest widoczne jako struktura w kształcie rombu.
Tutaj najważniejsze jest wypełnienie całego obszaru czwartej komory roztworem plazmidu, aby dostarczyć DNA również do dystalnej części zawiązka móżdżku. Jednocześnie upewnij się, że podczas tego procesu nie spowoduje to krwawienia.
Umieść platynową pęsetę wyposażoną w płytki elektrody o średnicy 5 milimetrów bocznie nad głową zarodka, tak aby biegun ujemny zakrywał ucho, a biegun dodatni umieszczony w zawiązkach móżdżku nad ścianą macicy i przyłożył elektryczne impulsy kwadratowe.
Gdy wszystkie zarodki zostaną poddane elektroporacji, ostrożnie umieść rogi macicy z powrotem w jamie brzusznej i wypełnij sterylnym PBS. Pozwól rogowi macicy przesunąć się do naturalnej pozycji. Wyłącz znieczulenie i umieść zwierzę brzuchem w dół w nowej klatce, aby mogło dojść do siebie.