Indukcja glejaka za pomocą transpozycji za pośrednictwem SB: technika generowania nowego modelu myszy przy użyciu integracji plazmidu SB za pośrednictwem transpozonu z mózgiem noworodka myszy

Zacznij od pobrania probówki zawierającej mieszankę plazmidów. Plazmid śpiącej królewny lub transpozonu SB jest zaprojektowany tak, aby przenosił transpozycyjny element składający się z onkogenu indukującego glejaka pochodzenia ludzkiego, umieszczonego między dwiema odwróconymi sekwencjami powtórzeń. Ponadto mieszanina ta zawiera plazmid transpozazy SB, który zawiera element wyrażający enzym transpozazy.

Teraz dodaj odpowiedni odczynnik do transfekcji do probówki. Odessać mieszaninę do wstrzykiwań do strzykawki wyposażonej w mikroigłę. Następnie zabezpiecz znieczulone szczenię myszy w pozycji leżącej na ramie stereotaktycznej. Wizualizuj obszar głowy szczeniaka, aby zlokalizować szwy czaszkowe. Umieść mikroigłę nad szwami czaszkowymi.

Wstrzyknąć mieszankę do komory bocznej - jamy w miąższu mózgu. Następnie roztwór ulega dyspersji w miąższu mózgu, gdzie cząsteczki odczynnika do transfekcji ułatwiają wnikanie plazmidów do komórek. Po wejściu do komórki plazmid transpozazy ulega ekspresji cząsteczek enzymu transporazy, które rozpoznają odwrócone sekwencje powtórzeń i wycinają element transpozonu.

Transpozycyjny element DNA następnie reintegruje się z regionem powtórzeń TA genomowego DNA szczenięcia. Transpozycja genetyczna powoduje onkogenną transformację komórek mózgowych, prowadzącą do rozwoju glejaka w mózgu myszy.

Na 3 do 4 tygodni przed eksperymentem należy założyć klatkę hodowlaną myszy z jednym samcem i jedną samicą. Dołącz kolorowe plastikowe igloo, aby wzbogacić środowisko i zwiększyć szanse na krycie. Usuń samca, gdy ciąża zostanie potwierdzona, a 18 dni po dniu krycia zacznij monitorować samicę pod kątem porodu. Upewnij się, że matka zastępcza jest dostępna w czasie porodu.

W pierwszej dobie po urodzeniu należy wykonać iniekcje dokomorowe. Przygotować roztwór do wstrzykiwań, najpierw porcjując 20 mikrolitrów mieszanki DNA zawierającej plazmidy transpozonów w końcowym stężeniu 0,5 mikrograma DNA na mikrolitr. Następnie dodaj 20-mikrolitrową porcję roztworu PEI do roztworu DNA i pozwól im inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut do godziny, po czym mieszaninę należy przechowywać na lodzie.

W przypadku igły do wstrzykiwań należy przymocować strzykawkę o pojemności 10 mikrolitrów do igły podskórnej o rozmiarze 30 pod kątem 12,5 stopnia. Następnie podłączyć strzykawkę do pompy z automatycznym wstrzykiwaniem. Przetestuj konfigurację z 10 mikrolitrami wody i pamiętaj o opróżnieniu strzykawki. Teraz schłodzić stadium stereotaktyczne noworodka zawiesiną suchego lodu i alkoholu. Po schłodzeniu do temperatury od 2 do 8 stopni Celsjusza należy przystąpić do wstrzykiwań.

Znieczul szczeniaka, umieszczając go na lodzie na 2 minuty. Gdy szczenię znajduje się na lodzie, naładować strzykawkę roztworem do wstrzykiwań. Po znieczuleniu przenieś szczeniaka do ramy i unieruchamij jego głowę między nausznikami pokrytymi gazą. Sprawdź, czy grzbietowa strona czaszki jest pozioma i równoległa do powierzchni ramy. Również szwy czaszkowe powinny być wyraźnie widoczne.

Jeśli głowa szczeniaka nie jest wystarczająco mocno unieruchomiona, będzie się poruszać podczas iniekcji, natomiast jeśli zostanie zbyt mocno ściśnięta między nausznikami ramy, lambda nie będzie widoczna, a ciśnienie w głowie wymusi wyciek wstrzykniętego roztworu.

Gdy szczeniak jest mocno uchwycony przez ramę, wytrzyj głowę 70% etanolem. Następnie opuść igłę i wyreguluj jej położenie tak, aby stykała się z lambdą. Następnie podnieś igłę i przesuń ją o 0,8 milimetra w bok i 1,5 milimetra w bok. Następnie opuść go ponownie, aż lekko wgłębi się w skórę. Zapisz współrzędne tej pozycji. Następnie opuść igłę o 1,5 milimetra przez skórę i czaszkę do kory w komorze bocznej.

Tam wstrzyknij 0,75 mikrolitra w ciągu 90 sekund i odczekaj minutę, aby roztwór się rozproszył. Podczas oczekiwania kolejne szczenię, które ma zostać wstrzyknięte, może zostać znieczulone. Po odczekaniu powoli podnieś igłę. Następnie przenieś szczenię do miejsca rekonwalescencji pod lampą grzewczą. Czas od znieczulenia do ocieplenia musi być krótszy niż 10 minut; Im szybciej, tym lepiej.

Monitoruj jego oddech i, jeśli to konieczne, delikatnie pocieraj kończyny, aby stymulować oddychanie. Gdy szczenię jest już rozgrzane, ma różowy kolor i spokojny oddech, zwróć je matce.