JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:33 min. • July 8th, 2025
Synaptosomy to izolowane frakcje neuronalne bogate w pęcherzyki synaptyczne. Te synaposomy są pochłaniane przez astrocyty - populację komórek odpornościowych w mózgu - w procesie znanym jako fagocytoza.
Aby zbadać fagocytozę za pośrednictwem astrocytów in vitro, zacznij od pobrania płytki hodowlanej zawierającej monowarstwę astrocytów. Teraz dodaj do płytki sprzężoną zawiesinę synaptosomów ze wskaźnikiem pH. Ten barwnik wskaźnikowy ma właściwość fluorescencji wyłącznie przy niskim pH. Inkubuj płytkę przez żądany czas.
Podczas inkubacji fosfatydyloseryna lub PS obecna na zewnętrznej błonie synaptosomu pozwala mu związać się z odpowiednimi receptorami PS na błonie astrocytów. Ułatwia to osadzanie się synaptosomów u podstawy. Odessać zużytą pożywkę wraz z niezwiązanymi synaptosomami z płytki.
Następnie uzupełnij płytkę w czynniki sprzyjające fagocytozie i inkubuj. Następnie zobrazuj płytkę za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Po związaniu się z powierzchnią astrocyty pochłaniają synaptosomy, powodując ich wejście do fagosomów. Po dostaniu się do fagosomów niskie pH powoduje, że cząsteczki barwnika wskaźnikowego jasno fluoryzują.
Obrazowanie w czasie rzeczywistym ujawnia obecność jasnych plamek fluorescencyjnych odpowiadających synaptosomom sprzężonym ze wskaźnikiem pH pochłoniętym przez astrocyty. W końcu plamy te znikają, co wskazuje na udaną degradację synaptosomów.
Aby zobrazować na żywo pochłanianie synaptosomów, najpierw usuń supernatant z każdej studzienki zlewającej się kultury astrocytów i szybko umyj komórki trzykrotnie 1 mililitrem DPBS na płukanie. Po ostatnim praniu dodaj 300 mikrolitrów immunopanowanej pożywki zasadowej astrocytów i 5 mikrolitrów synaptosomów sprzężonych ze wskaźnikiem pH, a także wszelkie dodatkowe czynniki, które mogą modulować fagocytozę komórek glejowych.
Pozwól synaptosomom osiąść na dnie studzienek i przyłączyć się do receptorów fosfatydyloseryny na astrocytach w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po 40 minutach wyrzucić supernatanty i szybko, ale delikatnie umyć studzienki trzykrotnie 1 mililitrem DPBS na przemycie.
Po ostatnim płukaniu dodaj 500 mikrolitrów świeżej pożywki uzupełnionej interesującymi czynnikami do odpowiednich studzienek i przenieś płytkę do przyrządu do obrazowania na żywo. Wybierz pozycje obrazowania, dostosuj ostrość, czas ekspozycji, jasność i moc diody LED, a następnie ustaw format obrazu, przedział czasu i całkowitą liczbę cykli obrazowania na żywo zgodnie z eksperymentalnymi potrzebami. Następnie rozpocznij obrazowanie na żywo eksperymentów z fagocytozą.