JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 4:21 min. • July 8th, 2025
Komórki ziarniste móżdżku są najliczniejszym typem neuronów w mózgu. Zewnętrzna warstwa ziarnista, EGL, składa się wyłącznie z prekursorów komórek ziarnistych, GCP, które różnicują się i migrują do wewnątrz, tworząc wewnętrzną warstwę ziarnistą, IGL.
Aby zobrazować rozwój komórek ziarnistych, przygotuj komorę elektroporacyjną, mocując anodę do podstawy szalki Petriego. Dodaj pożywkę hodowlaną, aby przykryć elektrodę. Teraz umieść wkładkę hodowlaną na elektrodzie pokrytej pożywką. Przenieś plastry móżdżku zarodka pisklęcia na wkładkę hodowlaną w orientacji strzałkowej.
Płaszczyzna strzałkowa pozwala na identyfikację warstwy docelowej - EGL na tle różnych warstw móżdżku. Dodać lepki roztwór barwnika zawierający plazmidowe DNA GFP na EGL. Plazmidowe DNA GFP koduje zielone białko fluorescencyjne, które rozprowadza się jednorodnie w cytoplazmie komórki i umożliwia obrazowanie żywych komórek.
Następnie umieść katodę w pożywce w pobliżu EGL, ale nie bezpośrednio na tkance. Następnie zastosuj wiele impulsów elektrycznych do różnych regionów EGL. Impulsy elektryczne indukują tymczasowe pory w błonie komórkowej, umożliwiając komórkom pobranie plazmidowego DNA. Następnie plazmidowe DNA umożliwia ekspresję GFP w komórkach ziarnistych.
Zobrazuj wycinki móżdżku pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby zaobserwować ziarniste różnicowanie komórek i wzorzec migracji na różnych etapach rozwoju komórki.
Zbuduj komorę elektroporacyjną, mocując anodę elektroporatora do podstawy 60-milimetrowej szalki Petriego za pomocą taśmy izolacyjnej. Dodaj około 1 mililitr HBSS, aby przykryć elektrodę. Następnie umieść wkładkę hodowlaną o wielkości 0,4 mikrometra na elektrodzie pokrytej HBSS.
Użyj 3-mililitrowej pipety Pasteura z odciętą końcówką, aby przenieść zidentyfikowane plastry, do 5 na wkładkę hodowlaną. Następnie oddziel plastry i pozwól im osiąść na wkładce hodowlanej w orientacji strzałkowej. Za pomocą pipety usuń nadmiar pożywki z wycinków mózgu. Pozwól, aby wkładka spoczywała na elektrodzie, tak aby istniał kontakt między wkładką a elektrodą.
W tej konfiguracji wkładka hodowlana z plastrami będzie spoczywać na powierzchni pożywki, utrzymując obwód, ale umożliwiając przestrzenne ukierunkowanie katody. Używając końcówki do pipety P10, odpipetuj 5 mikrolitrów DNA rozcieńczonego 20% Fast Green na powierzchni docelowego obszaru każdej warstwy. Dodatek Fast Green zapewnia, że roztwór DNA jest wystarczająco lepki, aby uniemożliwić szerokie rozproszenie DNA.
Następnie umieść katodę na żądanej tkance docelowej i poddaj próbki elektropolatacji. Unikaj bezpośredniego kontaktu katody z tkanką, umieszczając katodę jak najbliżej tkanki, bez faktycznego jej dotykania. Powtórz elektroporację w wielu obszarach zewnętrznej warstwy ziarnistej na każdym pojedynczym wycinku móżdżku zgodnie z potrzebami.
Po zakończeniu przenieś wkładkę hodowlaną na 30-milimetrową szalkę Petriego. Do każdej kultury dodaj 1 mililitr wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej pod wkładką kulturową. Upewnij się, że wkładka nie unosi się na podłożu. Wkładka hodowlana powinna stykać się z podłożem, ale plastry nie powinny być w nim kąpane.