JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 5:43 min • July 8th, 2025
Rozpocznij elektroporację od pobrania szklanej pipety zawierającej żądany roztwór plazmidu. Przymocuj ją do uchwytu na mikropipety wyposażonego w elektrodę ze srebrnym drutem, upewniając się, że elektroda jest włożona do mikropipety. Weźmy komorę do elektroporacji zawierającą ultracienki fragment hipokampa zanurzony w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym.
Zanurz elektrodę masową w płynie znajdującym się w komorze w celu późniejszej elektroporacji. Opuść końcówkę pipety do komory elektroporacyjnej i zapisz rezystancję podstawową. Użyj mikroskopu, aby umieścić końcówkę pipety w pobliżu celi docelowej. Gdy pipeta zetknie się z błoną neuronalną, jej opór gwałtownie wzrasta.
Zastosuj dodatnie ciśnienie powietrza, aby stworzyć niewielką wgłębienie w błonie neuronalnej. Szybko zastosuj łagodne ssanie, aby wypchnąć membranę do góry, tworząc luźne uszczelnienie między końcówką pipety a membraną. Powtórz ten proces jeszcze kilka razy, aby kondycjonować błonę i uniknąć lizy komórek.
Po kondycjonowaniu zastosuj silne ssanie, aby utworzyć szczelne uszczelnienie z membraną zwaną uszczelką gigaomową. Użyj impulsów elektrycznych, aby utworzyć przejściowe pory w uszczelnionym obszarze membrany. Otwory te ułatwiają wnikanie plazmidów do wnętrza docelowego neuronu. Po elektroporacji pory ponownie się zamykają, więżąc plazmidy wewnątrz neuronu.
Aby przygotować kultury warstwowe do elektroporacji, przenieś interesujące nas wkładki hodowlane na indywidualne 3-centymetrowe szalki Petriego załadowane 900 mikrolitrami pożywki hodowlanej i umieść kultury w stołowym inkubatorze dwutlenku węgla. Następnie wstępnie inkubuj świeże wkładki hodowlane z 1 mililitrem pożywki hodowlanej w plasterkach na wkładkę na 3,5-centymetrowej szalce Petriego przez co najmniej 30 minut i sterylizuj linie urządzenia do elektroporacji 10% wybielaczem przez 5 minut.
Pod koniec perfuzji przepłucz linie zjonizowaną wodą autoklawowaną przez co najmniej 30 minut przed perfuzją wysterylizowanego filtrem aCSF zawierającego 0,001 milimolowej tetrodotoksyny. Ustaw impuls elektroporatora na amplitudę minus 5 woltów, impuls prostokątny, ciąg 500 milisekund, częstotliwość 50 Hz i szerokość impulsu 500 mikrosekund. Napełnij szklaną pipetę 5 mikrolitrami roztworu wewnętrznego zawierającego plazmid i delikatnie strzepnij i postukaj końcówką kilka razy, aby usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki.
Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby upewnić się, że końcówka nie jest uszkodzona i bezpiecznie przymocuj końcówkę pipety do elektrody. Gdy końcówka zetknie się z płynem CSF, zapisz odczyt rezystancji pipety z elektroporatora. Aby wyizolować kulturę plastrową, odetnij membranę wkładki hodowlanej ostrym ostrzem i użyj kleszczyków o ostrym kącie, aby ostrożnie przenieść kulturę plastrów do komory elektroporacji. Następnie ustal pozycję kultury za pomocą kotwicy do plastrów.
W celu elektroporacji interesujących komórek należy przyłożyć dodatnie ciśnienie do pipety doustnie i za pomocą trójwymiarowych pokręteł sterujących manewrować końcówką pipety w pobliżu powierzchni kultury plastrowej. Oglądając kulturę pod mikroskopem, zbliż się do komórki docelowej końcówką, utrzymując nadciśnienie przyłożone, aż na powierzchni komórki utworzy się wgłębienie. Po wizualizacji wgłębienia szybko zastosuj doustnie łagodne podciśnienie, aby między końcówką pipety a błoną plazmatyczną utworzyło się luźne uszczelnienie.
Membrana nieznacznie wejdzie do pipety. Należy zaobserwować około 2,5-krotny wzrost początkowej rezystancji pipety, na co wskazuje wzrost tonu z głośników. Szybko ponownie zastosuj dodatnie ciśnienie, aby wgłębienie się zreformowało. Następnie natychmiast wykonaj co najmniej dwa kolejne cykle ciśnieniowe, jak właśnie pokazano, bez zatrzymywania się. Po ostatnim impulsie ciśnienia utrzymaj podciśnienie przez 1 sekundę. Ton z głośników osiąga stabilny szczyt wysokości. Użyj pedału nożnego, aby szybko uruchomić impuls elektroporatora.
Po elektroporacji delikatnie wycofaj pipetę na około 100 mikronów z celi bez wywierania nacisku i ponownie zastosuj nadciśnienie, sprawdzając, czy rezystancja jest podobna do odczytu linii bazowej przed zbliżeniem się do następnej celi. Gdy wszystkie interesujące nas komórki zostaną poddane elektroporacji, przenieś kulturę plastrową do jednej z przygotowanych świeżych wkładek hodowlanych i umieść wkładkę w temperaturze 35 stopni Celsjusza na okres do 3 dni.