JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 6:10 min. • December 22nd, 2025
[WSTAW FIGURE1 TUTAJ]
Rycina 1: Wycięty kręgosłup i rdzeń kręgowy uwolniony od 3-dniowej myszy noworodkowej. Strzałka w (a) wskazuje w kierunku ogonowego końca kręgosłupa, gdzie wprowadza się igłę w celu uwolnienia rdzenia kręgowego. Uwolniony rdzeń kręgowy (b) jest pokazany zanurzony w PBS.
[WSTAW FIGURE2 TUTAJ]
Rysunek 2: Gradient gęstości z komórkami dodanymi po odwirowaniu. Warstwy są obrysowane i lepiej zwizu
Aby wyizolować neurony rdzenia kręgowego, weź kręgosłup nowonarodzonej myszy i umieść go na szalce Petriego. Przepłucz kręgosłup buforem soli fizjologicznej, aby uwolnić rdzeń kręgowy. Przenieś rdzeń kręgowy do zimnego podłoża neuronalnego, aby ułatwić przeżycie komórki.
Następnie zmiel rdzeń kręgowy i przenieś fragmenty do rurki zawierającej świeże podłoże neuronalne. Inkubować probówkę w łaźni wodnej z wytrząsarką w celu aklimatyzacji. Po inkubacji usuń zużytą pożywkę i dodaj pożywkę do wytrawiania. Enzymy trawienne rozszczepiają macierz tkankową, aby rozluźnić komórki.
Wykonaj rozcieranie, odsysając fragmenty tkanki do pipety i szybko opróżnij składniki, uwalniając poszczególne komórki do zawiesiny. Następnie przenieść tę zawiesinę do probówki zawierającej pożywkę o gradientzie gęstości i wirówkę.
Po odwirowaniu powierzchowna warstwa probówki zawiera resztki tkanek. Pierwsza warstwa obejmuje oligodendrocyty i astrocyty. Druga i trzecia warstwa składają się z neuronów, przy czym trzecia warstwa ma najwyższą czystość. Wreszcie, osad zawiera komórki mikrogleju.
Zbierz trzecią warstwę do świeżej probówki i dodaj pożywkę neuronalną, aby rozcieńczyć pożywkę o gradiencie gęstości. Wirować w celu granulacji neuronów. Odrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w pożywce neuropodstawnej, aby zachować neurony do dalszych eksperymentów.
Aby rozpocząć tę procedurę, oddziel głowę od ciała uśpionych szczeniąt myszy za pomocą nożyczek. Następnie ustabilizuj ogon i ramiona na stole zabiegowym stroną grzbietową skierowaną do góry. Następnie odetnij skórę za pomocą zakrzywionych nożyczek do tęczówki. Następnie odetnij rdzeń kręgowy od odcinka lędźwiowego tuż nad biodrami, a następnie przetnij obie strony klatki piersiowej, aby oddzielić go od ciała.
Umyj próbki sekwencyjnie na trzech 10-centymetrowych szalkach Petriego zawierających 5 mililitrów wysterylizowanego PBS przez 10 sekund każda, aby usunąć nadmiar tkanki. Następnie włóż igłę i strzykawkę o rozmiarze 22 wypełnionymi 5 mililitrami wysterylizowanego PBS do ogonowego końca kręgosłupa i przepłucz czaszkę, umożliwiając wyjście pępowiny na czwartą szalkę Petriego.
Przenieś rdzeń kręgowy w 15-mililitrowej rurce z 5 mililitrami HABG na lodzie. Unikaj zmiażdżenia rdzenia kręgowego i powtórz procedury dla pozostałych szczeniąt. Idealnie byłoby, gdyby proces ten trwał nie dłużej niż 30 minut, aby jedna grupa szczeniąt zapewniła zdrową izolację neuronów.
Aby przygotować gradient gęstości, przygotuj każdą z czterech warstw w czterech 15-mililitrowych probówkach. Następnie dodaj 1 mililitr każdej warstwy do nowej 15-mililitrowej tuby. Zacznij od warstwy 1 na dole i dodawaj sekwencyjnie, aż dojdziesz do warstwy 4 na górze. Unikaj naruszania warstw podczas dodawania i wszelkich energicznych ruchów, które mogą powodować mieszanie. Następnie dodaj pożywkę trawiącą do zmielonej tkanki. Umieścić próbkę w wytrząsarce w łaźni wodnej o temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnie wyjmij chusteczkę z łaźni wodnej i pozwól jej osiąść przez kilka minut.
Aby przeprowadzić rozcieranie, odessać nadmiar pożywki trawiącej. Zawieś tkankę w 2 mililitrach HABG. Używając pipety o wąskim otworze, rozcieraj 10 razy w ciągu 45 sekund i unikaj wprowadzania powietrza, ponieważ znacznie zmniejszy to żywotną wydajność. Zaderanie jest jednym z najważniejszych etapów zabiegu. Tkankę należy ostrożnie wciągnąć i opróżnić z wypolerowanej ogniowo pipety, unikając nadmiaru wigoru, który może prowadzić do śmierci neuronów, lub będąc zbyt delikatnym, co spowoduje niską wydajność.
Następnie odessać górne 2 mililitry supernatantu i przenieść go do nowej 15-mililitrowej probówki oznaczonej jako "kolekcja". Powtórz procedury zbierania jeszcze dwa razy, aby uzyskać 6 mililitrów supernatantu. Następnie powoli przenieś zawartość probówki zbiorczej do przygotowanej wcześniej probówki gradientowej, unikając zakłócenia gradientu.
Aby oczyścić neurony, odwiruj probówkę gradientową przez 15 minut w temperaturze 800 x g i 22 stopniach Celsjusza. Zbierz żądane warstwy i przenieś je do nowej 15-mililitrowej tuby. Aby uzyskać izolację neuronów o najwyższej czystości, zbierz warstwę 3. Aby uzyskać większy plon przy mniejszej czystości, zbierz warstwy od 2 do 3.
Następnie rozcieńczyć gradient gęstości, dodając 5 mililitrów HABG do nowo zebranych warstw. Odwirować go przy 200 x g przez 2 minuty w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Po 2 minutach wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w 5 mililitrach HABG, strzepując osad. Następnie ponownie odwirować próbkę o sile 200 x g przez 2 minuty w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w 3 mililitrach pożywki neuropodstawnej, strzepując osad.