Wstrzykiwanie mikropęcherzyków do izolowanych zarodków myszy: technika dostarczania mikropęcherzykowych środków kontrastowych do naczyń krwionośnych żywych zarodków myszy

W celu dostarczenia mikropęcherzyków należy rozpocząć od równomiernej zawiesiny mikropęcherzyków lipidowych ukierunkowanych na komórki śródbłonka, zawierających gazowy rdzeń w strzykawce podłączonej do rurki.

Załaduj ten zestaw do pompy strzykawkowej i przymocuj szklaną igłę do rurki. Teraz przenieś schłodzony zarodek myszy wyrażający specyficzne receptory komórek śródbłonka do naczynia umieszczonego na stoliku stereoskopowym.

Delikatnie zewnętrzizować zarodek z woreczka żółtkowego i błony owodniowej. Zabezpiecz worek i krawędzie łożyska. Przepłucz zarodek ciepłym buforem, aby przywrócić mu przepływ krwi. Przykryj zarodek wstępnie podgrzanym żelem ultradźwiękowym, aby uzyskać optymalną transmisję fal ultradźwiękowych. Suplement z buforem w celu utrzymania jego fizjologicznych warunków.

Ostrożnie wstrzyknąć zawiesinę mikropęcherzyków z pożądaną szybkością przepływu do odpowiedniej żyły na powierzchni błony płodowej krążka łożyskowego za pomocą pompy strzykawkowej. Wstrzyknięte mikropęcherzyki przemieszczają się przez krążenie i wiążą się ze specyficznymi receptorami na komórkach śródbłonka wyściełających naczynia krwionośne.

Użyj głowicy ultradźwiękowej, aby przesłać fale ultradźwiękowe o wysokiej częstotliwości do zarodka. Wysoce ściśliwe rdzenie gazowe mikropęcherzyków powodują, że oscylują one nieliniowo, rozpraszając fale ultradźwiękowe o częstotliwościach innych niż fale padające. Sygnały te oraz sygnały liniowe tkanki wracają do przetwornika.

Przetwornik przekazuje je do systemu obrazowania, który odróżnia sygnały rozproszone w mikropęcherzykach od sygnałów tkankowych, tworząc obrazy ultrasonograficzne embrionalnych naczyń krwionośnych ze wzmocnieniem kontrastowym.

Odpipetować odpowiednią objętość roztworu podstawowego mikropęcherzyków i dodać do porcji soli fizjologicznej. Wymieszać, delikatnie mieszając końcówką pipety. Następnie za pomocą igły o rozmiarze 21 wciągnij rozcieńczony roztwór mikropęcherzyków do czystej strzykawki. Po wyjęciu igły należy usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza ze strzykawki i założyć luer oraz rurkę. Powoli dociśnij roztwór do końca rurki, uważając, aby nie wytworzyć żadnych pęcherzyków powietrza.

Na koniec włożyć strzykawkę do pompy infuzyjnej strzykawki ustawionej do dozowania mikropęcherzyków z szybkością 20 mikrolitrów na minutę, co daje całkowitą objętość 20 mikrolitrów. Przymocuj ciągniętą szklaną igłę do końca rurki. Przesunąć pompę w pobliże etapu wtrysku. Użyj perforowanej łyżki, aby losowo wybrać i usunąć jeden zarodek z naczynia ze schłodzonym podłożem. Umieść zarodek w naczyniu separacyjnym znajdującym się na stoliku ultrasonograficznym pod stereoskopem.

Następnie zlokalizuj stronę zarodka, która wydaje się najmniej unaczyniona. Oto obszar o niskim unaczynieniu, na ogół przylegający do obszaru głowy. Następnie użyj cienkich kleszczy, aby przeciąć lub rozerwać tylko tyle woreczka żółtkowego i błon owodniowych, aby móc usunąć zarodek od wewnątrz, ale nie więcej. Następnie delikatnie manewruj workiem od okolic zarodka. Następnie umieść zarodek na boku, z łożyskiem i naczyniami pępowinowymi z przodu.

Ustabilizuj naczynie preparacyjne za pomocą małych kawałków plasteliny. Za pomocą czterech szpilek do owadów przypnij woreczek żółtkowy i krawędzie łożyska, unikając głównych naczyń. Używając strzykawki zawierającej wstępnie podgrzany PBS o temperaturze 45 stopni Celsjusza, umyj zarodek, aż będzie można zobaczyć krew wpływającą do zarodka. Tętnicę pępowinową identyfikuje się po pulsacyjnej, jaskrawoczerwonej krwi. Żyła pępowinowa i związana z nią sieć naczyniowa mają ciemniejszą krew i zwykle nakładają się na te z tętnicy pępowinowej po stronie łożyska.

W tym momencie należy ustawić naczynie tak, aby można było wygodnie wykonać wstrzyknięcie. Gdy zarodek odżyje, przykryj go, ale nie łożysko, wstępnie podgrzanym żelem do ultradźwięków. Użyj cienkich kleszczyków, aby delikatnie usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z okolic zarodka i uzupełnij naczynie wstępnie podgrzanym PBS. Przez cały czas trwania zabiegu należy zwracać uwagę na poziom roztworu w strzykawkach PBS i strzykawkach z żelem, a w razie potrzeby dodawać zapasowe strzykawki do zlewki grzewczej.

Następnie zamontuj szklaną igłę na dużej kuli plasteliny na krawędzi naczynia do wycinki i włóż koniec igły do PBS. Wybierz żyłę na powierzchni kosmówki krążka łożyskowego tak daleko od głównej gałęzi, jak to możliwe. Następnie za pomocą nożyczek przyciąć końcówkę igły, aby dopasować ją do rozmiaru naczynia, przycinając końcówkę pod niewielkim kątem. Użyj krawędzi nożyczek sprężynowych, aby usunąć wszelkie postrzępione krawędzie szkła.

Teraz, za pomocą pompy strzykawkowej, powoli wstrzykiwać roztwór mikropęcherzyków w ilości 20 mikrolitrów na minutę do szklanej igły, aż całe powietrze zostanie usunięte z końcówki igły i będzie można zobaczyć, jak mikropęcherzyki swobodnie przepływają do PBS. Zatrzymaj pompę i zresetuj ją do objętości wtrysku 20 mikrolitrów. Nie należy dopuścić do przedostania się powietrza do igły do wstrzykiwań, aby uniknąć wstrzyknięcia powietrza do układu naczyniowego zarodka.

Delikatnie włóż szklaną końcówkę igły do wybranej żyły w łożysku i upewnij się, że jest ona nieruchoma. Odchylić głowicę stereoskopu i ustawić przetwornik ultrasonograficzny tak, aby zarodek znajdował się równomiernie między ogniskami na głębokości od 6 do 10 milimetrów. Następnie należy rozpocząć obrazowanie i rozpocząć wstrzykiwanie mikropęcherzyków w bolusie. Po minucie, po zakończeniu wstrzykiwania, uruchom stoper dla kroku zbierania danych.