Izolacja bakterii komensalnych spojówek na podstawie wymazówki: technika izolacji bakterii komensalnych z spojówki modelu mysiego

Spojówka oka jest siedliskiem bakterii komensalnych. Ta rodzima mikroflora chroni oko przed infekcjami, aktywując komórki odpornościowe do atakowania wszelkich szkodliwych drobnoustrojów, które dostają się do błony śluzowej oka.

Aby wyizolować bakterie komensalne, umieść znieczuloną mysz w pozycji bocznej. Weź sterylny wacik do oczu zamoczony w odpowiednim podłożu. Włóż mokrą końcówkę wacika do przyśrodkowej okolicy spojówki lewego oka. Wciśnij gałkę oczną i przesuwaj wacik w przód iw tył wzdłuż spojówki, aby zebrać zróżnicowaną populację komensalną.

Wyjmij wacik i wymieszaj go w probówce zawierającej pożywkę wzbogacającą drobnoustroje. Ten krok uwalnia uwięzione bakterie z bawełnianej siatki wacika do podłoża. Wyrzuć wacik i inkubuj probówkę, aby ułatwić początek rozwoju bakterii.

Dozować kilka kropli wzbogaconej pożywki z wymazu z oczu na płytkę z agarem z krwią w żądany wzór i inkubować. Kazeina i peptony sojowe obecne w pożywce dostarczają azot niezbędny do syntezy peptydów, podczas gdy chlorek sodu utrzymuje równowagę osmotyczną.

Bakterie komensalne posiadają enzymy hemolizyny, które trawią hemoglobinę obecną w pożywkach krwi. W ten sposób powstaje charakterystyczny wzór na płytce agarowej, powodując namnażanie się różnych bakterii w morfologicznie odrębne kolonie. Policz liczbę kolonii, aby określić ich względną liczebność w spojówce.

Upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona, ściskając podkładkę pod tylną stopę. Kontynuuj tylko wtedy, gdy nie ma ruchu. Przypisz jedną rękę do obsługi znieczulonych myszy, a drugą do obsługi wymazu z oka i hodowli. Wyjmij mysz z klatki i umieść ją na powierzchni roboczej umieszczonej na boku z odsłoniętym lewym okiem. Spryskaj dłonie w rękawiczkach izopropanolem i osusz je ręcznikiem papierowym.

Odkręć oznaczoną probówkę mikrowirówki BHI za pomocą dedykowanej ręki do obsługi pożywek i umieść probówkę z powrotem w stojaku. Zanurz pokrytą bawełną końcówkę wacika do oczu w BHI. Następnie wyjmij wacik z tubki, jednocześnie dwukrotnie obracając końcówką o rurkę wewnętrzną, aby usunąć nadmiar płynu i usunąć go.

Ręką trzymającą mysz delikatnie chwyć mysz za kark. Drugą ręką przyłóż końcówkę wacika do oka na przyśrodkowym obszarze spojówki lewego oka. Lekko wciśnij gałkę oczną i przesuń wacik ruchem mycia okien między dolną powieką a okiem 10 razy, utrzymując stały nacisk. Nie dotykając sierści, delikatnie zdejmij końcówkę wacika prostopadle do miejsca, w którym została włożona. Umieść wacik bawełnianą stroną do dołu bezpośrednio w oznakowanej probówce mikrowirówkowej z pożywką BHI.

Nałóż kroplę do oczu na pobrane oczko. W razie potrzeby zaopatrz się w wymazy ze skóry lub futra do próbek kontrolnych, odpowiednio sterylizując rękawiczki między każdym wacikiem. Po zakończeniu umieść mysz z powrotem w klatce. Odstaw wacik na 10 do 15 minut na lodzie. Następnie wysterylizuj ręce w rękawiczkach i wyjmij wacik, mieszając końcówkę z podłożem przez 10 obrotów. Wyjmij wacik, obracając końcówką o wewnętrzną ściankę probówki przez pięć obrotów i wyrzuć go do pojemnika stanowiącego zagrożenie biologiczne. Powtórz ten proces dla każdej myszy.

Wzbogać próbkę, inkubując probówki statycznie przez 1 godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Podczas inkubacji oznacz jedną płytkę TSA o temperaturze pokojowej na wymaz z oka myszy lub wacik kontrolny i podziel go na pół. Wyjąć wzbogacone próbki z inkubatora i umieścić je na lodzie. Krótko zmieszaj próbki, aby je wymieszać. Następnie naniec 10 mikrolitrów próbki na płytkę TSA i przechylić płytkę, aby utworzyć pasek. Powtórz to dwa razy.

Po drugiej stronie linii podziału płytki utwórz 10 kropek po 10 mikrolitrów próbki każda. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 godzin, 2 dni i 4 dni w czystej komorze, która zapobiega wysychaniu płytek agarowych. Policz kolonie w paskach. Zwróć uwagę na morfologię i oblicz jednostki tworzące kolonie na wymaz dla morfologicznie podobnych izolatów.