Izolacja komórek śródmiąższowych zastawki myszy: enzymatyczna metoda izolowania i hodowli VIC z mysiej zastawki aortalnej

Zastawka aortalna serca jest strukturą trójpłatkową składającą się z komórek śródmiąższowych zastawki wewnętrznej lub VIC rozmieszczonych w gęstej macierzy zewnątrzkomórkowej i leżących nad nią komórek śródbłonka zastawki lub VEC.

Aby wyizolować VIC, najpierw przygotuj uśpioną mysz w pozycji leżącej. Przez nacięcie w linii środkowej brzucha i klatki piersiowej odsłonić serce. Zrób małe nacięcie między lewym przedsionkiem a komorą, a następnie wykonaj perfuzję soli fizjologicznej, aby odprowadzić krew. Przetnij aortę wstępującą na poziomie łuku aorty i zbierz serce.

Przeciąć i odrzucić dystalne dwie trzecie komór przed podłużnym wycięciem pozostałej części serca, aby odsłonić płatki zastawki aortalnej w kształcie litery U. Usunąć ulotki i spłukać schłodzonym buforem w celu usunięcia krwi.

Następnie potraktuj ulotki roztworem kolagenazy o niskim stężeniu i inkubuj. W niskich stężeniach kolagenaza - enzym proteolityczny - tylko częściowo rozkłada macierz zewnątrzkomórkową, usuwając powierzchniowe VEC z listków.

Odwirować i zastąpić supernatant zawierający enzym buforem, przenosząc zawieszony osad na szalkę Petriego. Zbierz ulotki i potraktuj je roztworem kolagenazy o wysokim stężeniu do drugiego trawienia. Podczas inkubacji kolagenaza dalej degraduje macierz zewnątrzkomórkową, uwalniając VIC do roztworu.

Odwirować w celu osadzenia VIC i ponownego zawieszenia w odpowiednich podłożach. Na koniec należy zasiać niewielką objętość zawiesiny komórek na płytce wielodołkowej, aby ułatwić przyleganie VIC do dna studzienki. Inkubować, aby umożliwić namnażanie się VIC.

Przed rozpoczęciem eksperymentu wyczyść i wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne i przestrzeń roboczą 70% etanolem i autoklawuj narzędzia chirurgiczne przez 30 minut. Kiedy wstępna konfiguracja jest gotowa, zacznij od oczyszczenia klatki piersiowej i okolicy brzucha 8-tygodniowej myszy poddanej eutanazji za pomocą etanolu.

Za pomocą nożyczek otwórz brzuch i klatkę piersiową myszy. Następnie przeciąć między lewym przedsionkiem a lewą komorą małymi nożyczkami chirurgicznymi. Usuń krew z serca, przetapiając 10 mililitrów zimnego PBS i przetnij serce, zachowując 3 milimetry aorty wstępującej. Pod mikroskopem stereoskopowym rozetnij zastawkę aortalną, przecinając serce poziomo na środku komór i przecinając lewą komorę w kierunku aorty. Następnie ostrożnie rozwiń zastawkę aortalną. Połącz zastawki razem w małym 35-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowych.

Umyj izolowane zawory w 75-mililitrowym naczyniu do hodowli komórkowych z 5 mililitrami świeżo przygotowanych 10-milimolowych zimnych HEPES uzupełnionych antybiotykami i inkubuj w 5 mililitrach kolagenazy typu I przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z ciągłym wstrząsaniem. Po inkubacji odwirować probówkę przez 5 minut przy 150 x g i przemyć osad raz 2 mililitrami milimolowego HEPES-u z wirowaniem z dużą prędkością przez 30 sekund.

Zbierz powstałą zawiesinę z probówki do 35-milimetrowego naczynia hodowlanego i za pomocą cienkiej pęsety ostrożnie przenieś fragmenty tkanki do świeżej probówki. Następnie inkubować osad w 15-mililitrowej probówce w 5 mililitrach kolagenazy typu I w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod ciągłym mieszaniem przez 35 minut. Oddziel komórki przez ponowne zawieszenie za pomocą 1-mililitrowej pipety i odwiruj przy 150 x g przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Wyczyść komórki dwukrotnie, ponownie zawieszając oddzielony osad w 2 mililitrach kompletnego DMEM i odwirowując przy 150 x g przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Do posiewu ponownie zawiesić osad w 1 mililitrze kompletnego podłoża i dodać go do jednego dołka 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej w minimalnej ilości pożywki. Utrzymuj płytki w spokoju w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po 3 dniach inkubacji potwierdź wzrost bliżej resztek tkankowych, obserwując komórki pod mikroskopem. Gdy 1,000 komórek jest widocznych, ostrożnie usuń resztki tkanki za pomocą autoklawowanej pęsety i zmień podłoże.