JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Biologia
0 wyświetleń • 3:53 min. • July 8th, 2025
Zacznij od uśpionej myszy w pozycji leżącej. Wysterylizuj jego tylną kończynę. Chirurgicznie usuń skórę i powięź - cienką osłonkę tkanki łącznej pod skórą - aby odsłonić leżące poniżej mięśnie kończyn tylnych.
Zlokalizuj mięsień piszczelowy przedni lub TA po bocznej stronie kości piszczelowej. Trzymając dystalne ścięgno TA, odłącz mięsień od leżącej pod nim tkanki. Przetnij mięsień blisko kolana, aby wyciąć mięsień TA, odsłaniając leżący pod spodem mięsień prostownik długi palcowy lub mięsień EDL znajdujący się w przednim przedziale kończyny tylnej.
Naciąć dystalne ścięgno EDL i pociągnąć mięsień EDL w kierunku kolana. Przeciąć proksymalne ścięgno EDL, aby wyciąć mięsień EDL. Przenieś pobrany mięsień do probówki z podgrzanym podłożem zawierającym enzymy kolagenazy i inkubuj przez odpowiedni czas. Kolagenazy rozkładają tkankę łączną otaczającą każde włókno mięśniowe lub miofiber w mięśniu. Ten etap trawienia rozluźnia włókna mięśniowe z wewnętrznej warstwy mięśnia.
Po inkubacji ostrożnie przenieś strawiony mięsień na wielodołkową płytkę zawierającą podgrzane podłoże, aby zwiększyć przeżywalność włókien mięśniowych. Przenieś płytkę do podgrzewanego stolika mikroskopu stereoskopowego. Teraz delikatnie rozetnij strawiony mięsień, aby dysocjować i uwolnić poszczególne włókna mięśniowe do roztworu.
Wyizolowane włókna mięśniowe EDL można wykorzystać do dalszej analizy.
Spryskaj cały sprzęt i tylne kończyny myszy 70% etanolem. Użyj utwardzonych, drobno zakrzywionych nożyczek i cienkich kleszczy, aby usunąć skórę i odsłonić leżące pod nią mięśnie. Usuń otaczającą powięź za pomocą drobno zakrzywionych kleszczy, nie uszkadzając leżących pod spodem mięśni
.Aby usunąć piszczel przedni lub TA, chwyć dystalne ścięgno TA kleszczami i przetnij je drobnymi nożyczkami. Trzymając TA na ścięgnie, pociągnij je w kierunku kolana i przetnij mięsień blisko kolana, aby odsłonić mięsień EDL.
Podnieś dystalne ścięgno EDL za pomocą zakrzywionych kleszczyków i przetnij cienkimi nożyczkami sprężynowymi Vannas. Odsłoń proksymalne ścięgno EDL, ostrożnie pociągając EDL w kierunku kolana. Następnie przetnij ścięgno bliższe nożyczkami. Inkubować mięśnie EDL w probówce reakcyjnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza w krążącej łaźni wodnej. Przerwij trawienie, gdy mięśnie rozluźnią się i widoczne są pojedyncze włókna mięśniowe.
Pracując pod stereoskopowym mikroskopem dwuokularowym, wyposażonym w płytkę grzewczą, przepłucz mięśnie ciepłym medium izolacyjnym za pomocą pipety o dużej średnicy. Oddziel mięśnie za pomocą pipety o dużym otworze, aż pożądana liczba włókien mięśniowych będzie swobodnie unosić się w roztworze.