Elektroporacja myszy w macicy: kontrolowana czasoprzestrzenna transfekcja genów

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie skutecznej transfekcji genów w ośrodkowym układzie nerwowym myszy embrionalnej w pożądanym punkcie czasowym rozwoju i obszarze mózgu. Osiąga się to najpierw poprzez przygotowanie precyzyjnych naczyń włosowatych i elektrod igłowych, aby zapobiec uszkodzeniu macicy. Drugim krokiem procedury jest nauczenie się unikalnej metody przetrzymywania zarodków za pomocą światłowodu świetlnego do wizualizacji małych zarodków w celu celowego wstrzyknięcia DNA.

Trzecim etapem zabiegu jest wykonanie elektroporacji elektrodami typu patyczek na powierzchni macicy w celu transfekcji DNA do powierzchownych części mózgu, ostatnim etapem zabiegu jest wykonanie elektroporacji elektrodami igłowymi do głębszych struktur mózgu, takich jak wzgórze i podwzgórze. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wskazują na warstwę korową, specyficzną transfekcję lub skuteczną transfekcję we wzgórzu. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi bałaganami, takimi jak zwykłe, neutralne lacja, jest lepsza widoczność i kontrola miejsca lacji zarodków w macicy.

Używamy przypominającego światłowód, który umożliwia wizualizację zarodków z E 9,5 i hipocji igłowej w celu przekazania plazmidowego DNA do głębszych części mózgu, takich jak wzgórze i podwzgórze. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące rozwijającego się mózgu, takie jak różnicowanie neuronów, wzorce mózgu, połączenia neuronalne. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ trudno jest ukształtować igłę, drogę elektryczną i pozycję zbiorową.

Macica i zarodki Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, aby zobaczyć, jak wykonać precyzyjne elektrody igłowe i jak ustawić zarodki tak, aby były wolne od prądu. Ponieważ te dwa kroki są kluczem do pomyślnych wyników. Do przygotowania naczynek należy użyć ściągacza do mikropipet zgodnie z instrukcją producenta.

W tej procedurze używamy jednomilimetrowych szklanych kapilar bez wewnętrznego włókna. Ciągnięte igły powinny mierzyć od 800 mikrometrów do jednego milimetra od końcówki o średnicy zewnętrznej mniejszej niż 60 mikrometrów za pomocą mikroskopu preparacyjnego, a kleszcze ściskają końcówki igieł do średnicy od 20 do 30 mikrometrów. Zmierz każdą igłę za pomocą mikrometru.

Następnie przygotuj mikroelektrody przez zwijanie. Jeden koniec drutu wolframowego wokół pozłacanego kołka. Użyj drutu wolframowego do elektrod ujemnych i drutu platynowego do elektrod dodatnich.

Przymocuj drut do kołka za pomocą parametru. Następnie włóż drut do plastikowego trzpienia bawełnianego wacika i owiń oba końce kaprysem, równomiernie naostrz końcówkę drutu drobnym papierem ściernym, aż osiągnie 20 do 30 mikrometrów na końcu i 60 mikrometrów między 800 mikrometrami a jednym milimetrem od końcówki. Ponownie sprawdź ostateczne wymiary za pomocą mikrometru.

Następnie zanurz zaostrzony drut w kropli lakieru do paznokci, aby nałożyć cienką warstwę na cały drut w celu izolacji. Po wyschnięciu lakieru do paznokci użyj wacika z acetonem, aby usunąć go z ostatnich 200 mikrometrów patyczka z końcówką. Elektrody platynowe są kupowane w stanie gotowym i nie wymagają przygotowania.

W tej procedurze używamy CUY sześć 10 P cztery kreski i jedną elektrodę genu nepo Oczyść DNA osocza za pomocą metody maxi prep lub równoważnej, wymownie 100 mikrogramów DNA do nowej probówki i dodaj 10 mikrolitrów 1% szybkiego zielonego barwnika. Użyj TE, aby zwiększyć objętość do 100 mikrolitrów, aby uzyskać końcowe stężenie DNA w osoczu wynoszące jeden mikrogram na mikrolitr. Delikatnie wymieszaj roztwór, pipetując główkę, a następnie wiruj roztwór DNA przez pięć minut w temperaturze pokojowej 14 000 obr./min, aby usunąć zanieczyszczenia i sole.

Przenieś SNAT do nowej tuby. Roztwór DNA może być przechowywany w probówce w temperaturze pokojowej przez cały czas trwania zabiegu. Następnie podłącz wyciągniętą igłę do mikromanipulatora zgodnie z instrukcjami producenta, zanurz końcówkę igły w roztworze DNA, aby wypełnić igłę.

Ostrożnie odłóż mikromanipulator na bok i przygotuj się do operacji przed operacją. Zważ ciężarną mysz w dniach embrionalnych. 9,5 do 15,5 w celu określenia masy ciała.

Następnie dootrzewnowe. Wstrzykiwać pentobarbital sodu klasy farmaceutycznej w dawce 50 mikrogramów na gram masy ciała i masy ciała przez pięć minut. Alternatywą dla pentobarbitalu sodu może być ketamina, ksylazyna, wyrzutnik lub środki znieczulające gazowe.

Po znieczuleniu użyj żyletki i 50% etanolu, aby zgolić włosy z brzucha. Przygotuj skórę za pomocą naprzemiennych peelingów z Betadine i 70% alkoholu. Wykonaj nacięcie na linii środkowej brzucha cienkimi nożyczkami.

Ostrożnie wyciągnij wszystkie rogi macicy na sól fizjologiczną buforowaną fosforanem A lub wilgotną i bawełnianą gazę PBS umieszczoną wokół rany. Utrzymuj macicę wilgotną za pomocą PBS przez cały czas. Za pomocą elastycznego światłowodowego.

Umieść pod rogiem macicy. Umieść macicę między światłowodem a kciukiem i delikatnie ściśnij, aby popchnąć zarodek bliżej ściany macicy. Gdy zarodek zostanie umieszczony z głową po lewej stronie i skierowaną do góry, ostrożnie włóż szklaną kapilarnę do docelowej komory i wstrzyknij około jednego mikrolitra roztworu DNA do elektroporacji warstwy korowej cztery W dniu embrionalnym 13,5.

Umieść platynowe elektrody w sztyfcie na zewnątrz macicy i zastosuj impulsy prądu prostokątnego pięć razy przy użyciu 38 woltów przez 50 milisekund. W przypadku stosowania mikroelektroporacji w celu dotarcia do wzgórza lub podwzgórza w 10,5 dniu embrionalnym, należy wprowadzić cienką elektrodę ujemną wolframu do komory, do której wstrzyknięto DNA, a platynową elektrodę dodatnią do macicy. Umieść obszar docelowy między końcami obu elektrod i zastosuj sugerowane impulsy prądu prostokątnego trzy razy przy napięciu siedmiu woltów przez 100 milisekund.

Po zakończeniu elektroporacji przywróć róg macicy do pierwotnego położenia i dodaj 500 mikrolitrów PBS. Zszyj wewnętrzną warstwę nacięcia szwem chirurgicznym. Następnie zamknij zewnętrzną warstwę dziewięciomilimetrowym automatycznym klipsem.

Umieść mysz na poduszce grzewczej na dwie godziny, aby umożliwić powrót do zdrowia po operacji i patyczku anestezjologicznym. Platynowa elektroporacja obszaru korowego jest tutaj stosowana w dniach embrionalnych, 13,5, 14,5 i 15,5. Mózgi pobierano w okresie poporodowym.

Dzień szósty. Warstwa komórek korowych poddanych elektroporacji jest wyraźnie inna w każdym eksperymencie. Sugeruje to, że elektroporacja zależna od czasu umożliwia warstwom korowym specyficzne wzmocnienie funkcji i utratę funkcji.

Jak pokazano tutaj, elektroporacja do głębokich tkanek, takich jak wzgórze i podwzgórze. Używanie elektrod platynowych w sztyfcie często daje niską wydajność przy użyciu mikroelektrod do pracy elektrycznej. Te głębokie tkanki zapewniają lepszą wydajność i żywotność.

Wstrzyknęliśmy roztwór DNA osocza do trzeciej komory zarodków myszy. W 11,5 dniu embrionalnym zastosowaliśmy elektroporację igłową ograniczoną do wzgórza, większość eksonów wzgórza wydostaje się do kory mózgowej w szóstym dniu po urodzeniu. Tutaj pokazujemy mikroelektroporację P-C-A-G-E-Y-F-P do rozwijającego się głowowu.

Obszar wzgórza jest pokazany przez RORC, który oznacza wszystkie neurony postmitotyczne wzgórza. Projekcje aksonów pokazane białymi strzałkami w czwartej warstwie kory mózgowej mogą być również wizualizowane przez EYFP, który wypełnia cały neuron. Pozycja warstwy czwartej w korze jest również oznaczona przez przeciwciało RORC.

Po rozpoczęciu MA tę technikę można wykonać w 15 minut na litr, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby obchodzić się z testem bardzo ostrożnie, aby zapobiec uszkodzeniom Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak włączenie określonego chromu do MDNA, można przeprowadzić, aby zrozumieć molekularny mechanizm specyfikacji komórki po jej rozwoju.

Technika ta jest wykorzystywana przez naukowców zajmujących się rozwojem ośrodkowego układu nerwowego w celu zbadania mechanizmów molekularnych w zakresie wzorcowania, wzrostu aksonów i tworzenia obwodów.