Name: Elektroporacja myszy w macicy: kontrolowana czasoprzestrzenna transfekcja genów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-15T15:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji myszy w macicy do kontrolowanej transfekcji genów w rozwijającym się układzie nerwowym. Technika umożliwia precyzyjne badanie rozwoju mózgu z wykorzystaniem wizualizacji światłowodowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była finansowana przez RIKEN Brain Science Institute (BSI), Human Frontier Science Program (HFSP) (grant przyznany T.S.) oraz RIKEN Junior Research Associate Program (JRA, grant przyznany M.K.). RIKEN Brain Science Institute (BSI), Human Frontier Science Program (HFSP) (grant przyznany T.S.) oraz RIKEN Junior Research Associate Program (JRA, grant przyznany M.K.) sfinansowały tę pracę.

1. Przygotowanie kapilary i roztworu DNA do iniekcji
<ol>
	<li>Oczyść plazmidowe DNA metodą Maxi-prep lub równoważną, uzyskując stężenie końcowe 2-3 μg/μl. Odmierz 100 μg DNA, dodaj 10 μl barwnika fast green (stężenie zapasowe 1%) oraz bufor TE (roztwór 10mM Tris Base, 1mM EDTA, pH 8.0) i uzupełnij objętość do 100 μl, aby uzyskać końcowe stężenie DNA w mieszaninie do iniekcji wynoszące 1 μg/μl. Stężenie plazmidowego DNA może być zmieniane w zależności od wielkości plazmidu oraz jego wydajności transfekcji, co należy przetestować indywidualnie.</li>
	<li>Wirowarkuj roztwór DNA przez 5 minut przy 14,000 RPM w temperaturze pokojowej i zbierz nadsącz, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.</li>
	<li>Wytnij szklaną kapilarę za pomocą wyciągarki do mikropipet. Odetnij końcówkę pęsetą tak, aby średnica wierzchołka wynosiła 20–30 μm. Odmierz 800 μm-1 mm od końcówki i sprawdź, czy średnica zewnętrzna jest mniejsza niż 60 μm (Rys. 1A). </li> 
	<li>Podłącz kapilarę do mikromanipulatora i wypełnij ją olejem mineralnym. Aby napełnić kapilarę roztworem DNA, zanurz końcówkę w roztworze i zaciągnij roztwór DNA.</li>
</ol>

2. Przytwierdzanie elektrod platynowych
W niniejszym doświadczeniu zastosowano platynowe elektrody w formie igieł (Nepe gene, CUY611P2-1) do elektroporacji powierzchniowych obszarów mózgu, takich jak kora (Rys. 1F).

3. Przygotowanie mikroelektrod
Użyj mikroelektrod do przeprowadzenia elektroporacji w głębokich obszarach mózgu (tj. w wzgórzu i podwzgórzu) (Rys. 2B-E).

<ol>
	<li>Jeden koniec drutów wolframowych (dla elektrod ujemnych) i platynowych (dla elektrod dodatnich) owija się wokół pozłacanych pinów i mocuje parafilmem. Drut należy wsunąć w trzonek patyczka higienicznego i owinąć oba końce parafilmem (Rys. 1B).</li>
	<li>Koniec drutu należy równomiernie zaostrzyć papierem ściernym, aż osiągnie średnicę zewnętrzną 20–30 μm oraz 60 μm na odcinku od 800 μm-1 mm od czubka (Rys. 1C i D).</li> 
	<li>W celu izolacji należy nanieść na drut cienką warstwę lakieru do paznokci. Po wyschnięciu lakieru należy go usunąć z końcówki (około 200 μm od czubka) za pomocą patyczka higienicznego nasączonego acetonem. 
	Ważna uwaga: Aby zapobiec uszkodzeniu macicy myszy, odcinek w promieniu 800 μm-1 mm od czubka nie powinien przekraczać 70 μm średnicy (Rys. 1E).</li>
</ol>

4. Przygotowanie do operacji
<ol>
	<li>Zanurz mysz w stanie ciąży (E9.5-E15.5) w narkozie. Prezentujemy znieczulenie przy użyciu sodowego pentobarbitalu klasy farmaceutycznej (Tabela II; 50 μg na gram masy ciała, wstrzykiwanie domięśniowo i odczekanie 5 min). Alternatywami dla sodowego pentobarbitalu jako środka znieczulającego są iniekcje ketaminy/ksylazyny lub środki znieczulające w formie gazowej (gaz jest preferowany w przypadku procedur o krótkim czasie trwania). Iniekcję należy przeprowadzić z zachowaniem ostrożności, aby uniknąć uszkodzenia organów, w przeciwnym razie może dojść do uszkodzenia macicy lub śmierci zwierzęcia. Po prawidłowo wykonanej iniekcji IP przeżywalność wynosi ponad 95%. Zabieg można również przeprowadzać w środowisku otwartym. Przed rozpoczęciem operacji należy sprawdzić brak reakcji zwierzęcia na uszczypnięcie w palec u nogi, aby potwierdzić działanie znieczulenia.</li>
	<li>Wygolić sierść z brzucha za pomocą żyletki i 50% EtOH. Przygotować skórę, naprzemiennie przecierając ją betadyną i alkoholem (70%).</li>
	<li>Za pomocą precyzyjnych nożyczek wykonać nacięcie w linii środkowej brzucha i ostrożnie wysunąć wszystkie rogi macicy na nawilżoną 37 °C fosforanem sodu w roztworze soli (PBS) gazę bawełnianą, umieszczoną wokół rany. Przez cały czas należy utrzymywać macicę w wilgotnym stanie za pomocą PBS.</li>
	<li>Trzymać elastyczny kabel światłowodowy między palcem wskazującym a środkowym i umieścić go pod rogiem macicy. Przed użyciem oczyścić kabel 70% EtOH. Do wizualizacji nie jest wymagany mikroskop ani lupa. Umieścić macicę pomiędzy światłowodem a kciukiem i delikatnie ścisnąć, aby przesunąć embrion bliżej ściany macicy.</li>
</ol>

5. Iniekcja DNA i elektroporacja
<ol>
	<li>Po ustawieniu zarodka, ostrożnie wprowadź szklaną kapilarę do docelowego komory i wstrzyknij ok. 1 μl roztworu DNA (Rys. 2A).</li> 
	<li>W przypadku elektroporacji powierzchownych części mózgu, przy użyciu sztywnych elektrod platynowych, umieść elektrody na zewnątrz macicy i przyłóż sugerowane prostokątne impulsy prądu zgodnie z instrukcją producenta (Tabela I). W celu elektroporacji głębszych części mózgu (mikroelektroporacji) stosuje się elektrody igłowe. Wprowadź cienką wolframową elektrodę ujemną do komory, do której wstrzyknięto DNA, a elektrodę platynową do macicy, tak aby obszar docelowy znajdował się pomiędzy dwiema elektrodami, a następnie przyłóż sugerowane prostokątne impulsy prądu (Tabela I) (Rys. 2B).</li> 
</ol>

6. Po elektroporacji
<ol>
	<li>Umieść róg macicy z powrotem w pierwotnym położeniu i dodaj 500 μL uprzednio ogrzanego do 37 °C PBS.</li>
	<li>Zeszyj warstwę wewnętrzną szwem chirurgicznym, a warstwę zewnętrzną zamknij za pomocą 9 mm autoclipauto clip.</li>
	<li>Umieść zwierzęta na podgrzewaczu przez 2 godziny, aby umożliwić wybudzenie z narkozy. W celu uśmierzenia bólu pooperacyjnego można podać leki przeciwbólowe, takie jak karprofen lub buprenorfina.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki:
Na rysunku Figure 32 przedstawiono przykłady elektroporacji kory konstruktem pCAG-EYFP przy użyciu platynowych elektrod w różnych punktach czasowych. Mózgi poddano elektroporacji w dniach E13.5, E14.5 i E15.5, a następnie pobrano w 6. dniu postnatalnym (P6). Barwienie przeciwciałem przeciwko RORc ujawnia położenie warstwy 4, natomiast położenie komórek przetransfekowanych EYFP jest widoczne dzięki barwieniu przeciwciałem przeciwko GFP; oba obrazy zostały nałożone na siebie (Rys. 3A i B). Warstwa oznakowanych komórek kory poddanych elektroporacji jest wyraźnie różna w każdym z eksperymentów (Rys. 32), co sugeruje, że elektroporacja zależna od czasu umożliwia uzyskanie specyficzności dla poszczególnych warstw kory w badaniach GOF/LOF.
Żywotność embrionów oraz wydajność transfekcji komórek różnią się w zależności od wieku embrionu i miejsca przeprowadzania elektroporacji. Próbki wymieniono w Tabeli 1, jednak warunki powinny być optymalizowane dla każdej elektroporacji w zależności od stadium i części mózgu.
Elektroporacja w tkankach głębokich, takich jak wzgórze i podwzgórze, z wykorzystaniem sztyftowych elektrod platynowych często charakteryzuje się niską wydajnością (Tabela 1). Problem ten można rozwiązać poprzez zastosowanie mikroelektrod, które docierają do głębokich obszarów mózgu. Rysunek 3 4 przedstawia przykład elektroporacji pCAG-EYFP w rozwijającym się międzymózgowiu. Roztwór plazmidowego DNA wstrzykuje się do 3rd komora w stadium E11.5, a następnie mikroelektroporacja (Rys. 3C4C). Obszar poddany elektroporacji jest ograniczony do wzgórza, gdzie większość aksonów rzutuje do kory (Rys. 3B4B). Projekcje aksonalne do warstwy 4 kory można również zwizualizować za pomocą EYFP, który wypełnia cały neuron.Rys. 3A4A).
<img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig1.jpg" alt="Schemat wykonania mikroelektrod; obejmuje montaż i pomiary końcówki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Schematyczna ilustracja przedstawiająca prawidłowy kształt kapilary. (A) Szklana rurka kapilarna jest wyciągana za pomocą wyciągarki do mikropipet w celu uzyskania określonego kształtu. Końcówka jest odcinana pęsetą tak, aby osiągnęła średnicę 20–30 μm. Należy zmierzyć odległość 800 μm-1 mm od końcówki (czerwony nawias) i upewnić się, że średnica zewnętrzna wynosi mniej niż 60 μm (zielony nawias). (B) Jeden koniec drutów wolframowych lub platynowych jest owijany wokół pozłacanych pinów i mocowany parafilmem. Następnie za pomocą papieru ściernego formuje się ich końcówki tak, aby średnica zewnętrzna wynosiła 20-30 μm, a 60 μm w odległości od 1 mm od końcówki. (C) Obraz drutu wolframowego przed formowaniem. (D) Obraz drutu wolframowego po formowaniu. (E) Obraz drutu wolframowego po nałożeniu cienkiej warstwy lakieru do paznokci. Pasek skali na rysunku E wynosi 10 μm (najmniejsza skala) dla rysunków C-E. (F) Elektrody platynowe w formie pręcików (Nepa gene. CUY611P2-1). Pasek skali na rysunku F wynosi 2 mm.
<img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig2.jpg" alt="Schemat elektroporacji; iniekcja do komory bocznej vs. trzeciej komory; technika modyfikacji genetycznej embrionów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Schematyczny rysunek procedury chirurgicznej. (A) Schemat iniekcji do komory bocznej lub dużych embrionów (lewa strona) oraz do 3rd komory lub małych embrionów (prawa strona). (B) Schemat elektroporacji za pomocą platynowej elektrody prętowej (lewa strona) oraz elektrody igłowej (prawa strona).
<img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig3.jpg" alt="Etapy rozwoju neuronalnego, ekspresja GFP/RORc, obrazy mikroskopowe, dni embrionalne E13.5-E15.5." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Rozwijający się teleencephalon myszy poddano elektroporacji pCAG-EYFP w E13.5 (A), E14.5 (B) i E15.5 (C), a następnie pobrano w P6. Mózgi pocięto w płaszczyźnie czołowej i barwiono oddzielnie przeciwciałem przeciwko GFP lub przeciwciałem przeciwko RORc, a następnie nałożono obrazy na siebie. (A) Elektroporacja plazmidu pCAG-EYFP w E13.5 powoduje transfekcję wielu neuronów warstwy 4, które pokrywają się z markerami warstwy 4 RORc. (B) Elektroporacja plazmidu pCAG-EYFP w E14.5 powoduje transfekcję komórek, które znajdują się bardziej powierzchownie niż neurony warstwy 4. (C) Elektroporacja w E15.5 znakuje wiele neuronów powierzchownych, takich jak neurony warstwy 2/3.
Pasek skali 200 μm.
<img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig4.jpg" alt="Ekspresja GFP i RORc w korze i wzgórzu; schemat rozwoju mózgu, mikroskopia fluorescencyjna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> Rycina 4. Transfekcja EYFP do aksonów wzgórzowo-korowych (TCA). (A) Zakończenia TCA w 4. warstwie kory wykazane za pomocą barwienia przeciwciałem przeciwko GFP. Do wyznaczenia położenia 4. warstwy wykorzystano barwienie przeciwciałem przeciwko RORc. Oba obrazy zostały pobrane z tego samego przekroju i nałożone na siebie. (B) Miejsce elektroporacji we wzgórzu wykazane za pomocą barwienia przeciwciałem przeciwko GFP oraz barwienia RORc, którego ekspresja we wzgórzu jest ograniczona 11. (C) Przedstawiono schematyczny rysunek elektroporacji wzgórza i projekcji TCA. Pasek skali 200 μm.

<ol><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294, 1071-1074 (2001).</li>
<li>Kataoka, A., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+controls+regional+identity+in+the+developing+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus.</a> Development. 135, 2873-2881 (2008).</li>
<li>Imayoshi, I., Shimogori, T., Ohtsuka, T., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hes+genes+and+neurogenin+regulate+non-neural+versus+neural+fate+specification+in+the+dorsal+telencephalic+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hes genes and neurogenin regulate non-neural versus neural fate specification in the dorsal telencephalic midline.</a> Development. 135, 2531-2541 (2008).</li>
<li>Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+signaling+centers+expressing+BMP%2C+WNT+and+FGF+proteins+interact+to+pattern+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex.</a> Development. 131, 5639-5647 (2004).</li>
<li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Development Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).</li>
<li>Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Avian Embryology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTakahashi%2C+Y+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. Vol 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. 271-271 (2008).</li>
<li>Feil, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-activated+site-specific+recombination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ligand-activated site-specific recombination in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 10887-10890 (1996).</li>
<li>Indra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally-controlled+site-specific+mutagenesis+in+the+basal+layer+of+the+epidermis%3A+comparison+of+the+recombinase+activity+of+the+tamoxifen-inducible+Cre-ERT+and+Cre-ERT2+recombinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Temporally-controlled site-specific mutagenesis in the basal layer of the epidermis: comparison of the recombinase activity of the tamoxifen-inducible Cre-ERT and Cre-ERT2 recombinases.</a> Nucleic Acids Research. 27, 4324-4327 (1999).</li>
<li>Nakagawa, Y., O'Leary, D. D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+patterned+expression+of+orphan+nuclear+receptor+genes+ROR+alpha+and+ROR+beta+in+developing+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynamic patterned expression of orphan nuclear receptor genes ROR alpha and ROR beta in developing mouse forebrain.</a> Developmental Neuroscience. 25, 234-244 (2003).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym protokole opisano jedynie zalety techniki transfekcji pCAG-EYFP do ograniczonego obszaru małego mózgu zarodkowego przy użyciu elektrod o różnych kształtach. Porównanie wydajności transfekcji przy użyciu różnych promotorów, wykazujące specyficzność względem typu komórek, zostało opisane wcześniej 1. Istnieją jednak ograniczenia tej techniki; na przykład transfekcja jest jedynie przejściowa i różni się w zależności od plazmidu, nie wykazuje specyficzności komórkowej, a kontrola liczby przetransfekowanych komórek jest utrudniona. Niemniej jednak połączenie tego protokołu z innymi technikami zapewni dalsze możliwości zastosowania różnych metod manipulacji. Po pierwsze, włączenie do plazmidowego DNA promotora specyficznego dla danej komórki umożliwi transfekcję specyficzną dla typu komórek, takich jak neurony, komórki glejowe i astrocyty. Po drugie, ponieważ transfekcja jest przejściowa, nie jest ona odpowiednia dla naukowców chcących analizować funkcję genu w późniejszym etapie życia. Dlatego połączenie z transpozazą w celu zintegrowania plazmidowego DNA z genomem przekształci ją w transfekcję stabilną 8. Następnie zastosowanie systemu tet-on lub tet-off umożliwi manipulowanie czasem lub specyficzną dla typu komórek ekspresją genów w komórkach nerwowych 8. Alternatywnie protokół ten można połączyć z indukowanymi tamoksyfenem rekombinazami Cre-ER(T) 9 oraz myszami reporterowymi 10.
Szeroka dostępność tkanek drastycznie zmieni projekty eksperymentalne stosowane w neuronauce.

<table><tbody><tr><td>goły drut wolframowy o średnicy 125 &amp;mu;m</td><td>A-M Systems</td><td>797600</td><td></td></tr><tr><td>goły drut platynowy o średnicy 125 &amp;mu;m</td><td>A-M Systems</td><td>767000</td><td></td></tr><tr><td>elektrody w formie pręcików</td><td>Nepa gene</td><td>CUY610P4-1</td><td></td></tr><tr><td>szklana rurka kapilarna</td><td>Stoelting Co.</td><td>50611</td><td></td></tr><tr><td>mikromanipulator</td><td>KD Scientific</td><td>KDS310</td><td></td></tr><tr><td>nożyczki</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5865</td><td></td></tr><tr><td>generator impulsów</td><td>A-M Systems</td><td>Model 2100</td><td></td></tr><tr><td>klips autoklawowalny 9 mm</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-9260</td><td></td></tr><tr><td>piny pozłacane</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>5482</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało RORc</td><td>Perseus Proteomics</td><td>H3925</td><td></td></tr></tbody></table>

elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Aby zrozumieć funkcję genów eksprymowanych w specyficznych obszarach rozwijającego się mózgu, w tym cząsteczek sygnałowych i cząsteczek kierujących wzrostem aksonów, konieczny jest lokalny transfer genów lub ich nokaut. Celowane wprowadzanie genów (knock-in) lub ich usuwanie (knock-out) w lokalnych obszarach jest możliwe do przeprowadzenia w połączeniu ze specyficzną linią CRE, co jest jednak pracochłonne, kosztowne i czasochłonne. Dlatego prosta metoda transfekcji – technika elektroporacji in utero, którą można przeprowadzić w krótkim czasie – okaże się przydatna do testowania potencjalnych funkcji genów kandydackich przed stworzeniem zwierząt transgenicznych 1,2. Ponadto elektroporacja in utero pozwala na celowanie w obszary mózgu, dla których nie istnieją specyficzne linie CRE, oraz ogranicza śmiertelność zarodkową 3,4. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę elektroporacji in utero łączącą dwa różne typy elektrod w celu prostego i wygodnego transferu genów do docelowych obszarów rozwijającego się mózgu. Po pierwsze, unikalna metoda unieruchamiania zarodków za pomocą światłowodu sprawi, że małe zarodki (od E9.5) będą widoczne, co umożliwi celowe wstrzyknięcie roztworu DNA do komór mózgu oraz wprowadzenie elektrod igłowych do docelowego obszaru mózgu 5,6. Wzorowanie mózgu, np. w obszarze kory, zachodzi na wczesnym etapie embrionalnym, dlatego wczesna elektroporacja od E9.5 wnosi istotny wkład w zrozumienie całego procesu wzorowania obszarów. Po drugie, precyzyjny kształt kapilary zapobiega uszkodzeniu macicy podczas wykonywania otworów przez jej wprowadzenie. Ponadto precyzyjny kształt elektrod igłowych uzyskuje się z drutu wolframowego i platynowego, ostrząc go papierem ściernym i izolując lakierem do paznokci 7 – metoda ta jest szczegółowo opisana w niniejszym protokole. Ta unikalna technika pozwala na transfekcję plazmidowego DNA do ograniczonych obszarów mózgu i umożliwi elektroporację małych zarodków. Pomoże to otworzyć nowe możliwości dla wielu naukowców zajmujących się różnicowaniem komórek, migracją komórek i kierowaniem wzrostem aksonów na bardzo wczesnym etapie embrionalnym. Co więcej, technika ta pozwoli naukowcom na transfekcję plazmidowego DNA do głębokich części rozwijającego się mózgu, takich jak wzgórze i podwzgórze, gdzie nie istnieje wiele specyficznych dla regionu linii CRE do analiz funkcji zyskanej (GOF) lub utraconej (LOF).

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Aby zrozumieć funkcję genów eksprymowanych w konkretnym obszarze rozwijającego się mózgu, w tym cząsteczek sygnałowych i cząsteczek kierujących wzrostem aksonów...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie wydajnej transfekcji genów w rozwijającym się ośrodkowym układzie nerwowym myszy w wybranym punkcie czasowym rozwoju oraz w określonym obszarze mózgu. Osiąga się to najpierw poprzez przygotowanie precyzyjnych kapilar i elektrod igłowych, aby zapobiec uszkodzeniu macicy. Drugim krokiem procedury jest opanowanie unikalnej metody trzymania embrionów przy użyciu światłowodowego kabla oświetlającego, co pozwala na wizualizację małych embrionów w celu ukierunkowanej iniekcji DNA.Trzecim krokiem procedury jest przeprowadzenie elektroporacji za pomocą elektrod typu pałeczka na powierzchni macicy w celu transfekcji DNA do powierzchownych części mózgu; ostatnim krokiem procedury jest elektroporacja za pomocą elektrod igłowych w głąb struktur mózgu, takich jak wzgórze i podwzgórze. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące specyficzną transfekcję warstw korowych lub wydajną transfekcję we wzgórzu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak standardowa in utero elektroporacja, jest większa widoczność i kontrola nad miejscem elektroporacji embrionów w macicy.Używamy kabla przypominającego światłowód, który umożliwia wizualizację embrionów z etapu E 9.5 oraz mikroigieł do wprowadzania plazmidowego DNA do głębszych obszarów mózgu, takich jak wzgórze i podwzgórze. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące rozwijającego się mózgu, takie jak różnicowanie neuronów, wzorce budowy mózgu oraz łączność neuronalna. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ precyzyjne ukształtowanie igły, ułożenie elektrody i wspólne pozycjonowanie są wymagające.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, aby zobaczyć, jak wykonać precyzyjne elektrody igłowe oraz jak pozycjonować embriony do elektroporacji. Te dwa kroki są kluczowe dla uzyskania pomyślnych rezultatów. Do przygotowania kapilar należy użyć wyciągacza mikropipet zgodnie z instrukcją producenta.W tej procedurze stosujemy szklane kapilary o średnicy jednego milimetra bez wewnętrznego włókna. Wyciągnięte igły powinny mieć długość od 800 µm do 1 mm od końcówki, przy średnicy zewnętrznej mniejszej niż 60 µm; za pomocą mikroskopu sekcyjnego i pęsety przycina się końcówki igieł do średnicy od 20 do 30 µm. Każdą igłę należy zmierzyć za pomocą mikrometru.Następnie przygotuj mikroelektrody poprzez nawijanie. Jeden koniec drutu wolframowego owiń wokół pozłacanego pinu. Do elektrod ujemnych użyj drutu wolframowego, a do elektrod dodatnich drutu platynowego.Przymocuj drut do pinu za pomocą param. Następnie włóż drut do plastikowej rurki patyczka higienicznego i równomiernie owiń oba końce folią phim. Starannie oszlifuj końcówkę drutu drobnym papierem ściernym, aż osiągnie ona średnicę od 20 do 30 µm na samym wierzchołku oraz 60 µm w odległości od 800 µm do 1 mm od końcówki. Ponownie sprawdź końcowe wymiary za pomocą mikrometru.Następnie zanurz zaostrzony drut w kropli lakieru do paznokci, aby nałożyć cienką warstwę izolacyjną na cały drut. Po wyschnięciu lakieru użyj patyczka higienicznego nasączonego acetonem, aby usunąć go z ostatnich 200 micrometers końcówki drutu. Elektrody platynowe są kupowane jako gotowe produkty i nie wymagają przygotowania.W tej procedurze używamy elektrod CUY six 10 P four dash one nepo gene. Oczyszczamy plazmowy DNA metodą maxi prep lub równoważną, przenosimy 100 µg DNA do nowej probówki i dodajemy 10 µL 1% barwnika fast green. Używamy buforu TE, aby zwiększyć objętość do 100 µL, osiągając końcowe stężenie plazmowego DNA wynoszące 1 µg/µL. Roztwór delikatnie mieszamy pipetując, a następnie wirujemy roztwór DNA przez pięć minut przy 14 000 RPM w temperaturze pokojowej w celu usunięcia zanieczyszczeń i soli.Przenieś SNAT do nowej probówki. Roztwór DNA może być przechowywany w probówce w temperaturze pokojowej przez cały czas trwania procedury. Następnie podłącz dociągniętą igłę do mikromanipulatora zgodnie z instrukcją producenta i zanurz końcówkę igły w roztworze DNA, aby ją napełnić.Ostrożnie odstaw mikromanipulator i przygotuj się do zabiegu przed rozpoczęciem operacji. Zważ ciężarną mysz w dniach embrionalnych od 9,5 do 15,5, aby określić masę ciała.Następnie, drogą dosytroniczną. Wstrzyknij pentobarbital sodu stopnia farmaceutycznego w dawce 50 µg na gram masy ciała i odczekaj pięć minut. Alternatywami dla pentobarbitalu sodu mogą być ketamina, ksylazyna, zewnątrztrachealne środki znieczulające lub anestetyki gazowe.Po znieczuleniu użyć żyletki i 50% etanolu, aby ogolić sierść z brzucha. Przygotować skórę, stosując naprzemienne przemywanie Betadyną i 70% alkoholem. Wykonać nacięcie w linii środkowej brzucha za pomocą cienkich nożyczek.Ostrożnie wyciągnij wszystkie rogi macicy na zwilżoną 1x fosforanem soli buforowej (PBS) gazę bawełnianą umieszczoną wokół rany. Przez cały czas utrzymuj macicę w stanie wilgotnym, używając PBS. Wykorzystaj do tego elastyczny kabel światłowodowy.Umieść kabel pod rogiem macicy. Ustabilizuj macicę pomiędzy światłowodem a kciukiem i delikatnie uciśnij, aby przesunąć embrion bliżej ściany macicy. Gdy embrion zostanie ustawiony głową w lewo i skierowany ku górze, ostrożnie wprowadź szklaną kapilarę do docelowej komory i wstrzyknij około 1 µL roztworu DNA w celu elektroporacji czwartej warstwy kory w 13,5 dniu embrionalnym.Umieść prętowe elektrody platynowe na zewnątrz macicy i przyłóż pięć impulsów prądu prostokątnego o napięciu 38 V przez 50 ms. W przypadku zastosowania mikroelektroporacji w celu dotarcia do wzgórza lub podwzgórza w 10,5 dniu embrionalnym, wprowadź cienką wolframową elektrodę ujemną do komory, do której wstrzyknięto DNA, a platynową elektrodę dodatnią do macicy. Umieść obszar docelowy pomiędzy końcami obu elektrod i przyłóż sugerowane trzy impulsy prądu prostokątnego o napięciu 7 V przez 100 ms.Po zakończeniu elektroporacji przywróć róg macicy na jego pierwotne miejsce i dodaj 500 µL PBS. Zaszyj wewnętrzną warstwę nacięcia szwem chirurgicznym. Następnie zamknij warstwę zewnętrzną za pomocą dziewięciomilimetrowego klipsa automatycznego.Umieść mysz na podgrzewaczce przez dwie godziny, aby umożliwić regenerację po operacji i znieczuleniu. Przedstawiono tutaj electroporację platynową obszaru korowego zastosowaną w dniach embrionalnych 13,5, 14,5 oraz 15,5. Mózgi pobrano w okresie postnatalnym.Dzień szósty. Warstwa elektroporowanych komórek korowych wyraźnie różni się w każdym eksperymencie. Sugeruje to, że elektroporacja zależna od czasu umożliwia specyficzne dla warstw korowych uzyskanie funkcji (gain of function) oraz utratę funkcji (loss of function).Jak pokazano tutaj, przeprowadzono elektroporację w głębokich tkankach, takich jak wzgórze i podwzgórze. Stosowanie sztywnych elektrod platynowych często skutkuje niską wydajnością, dlatego do elektroporacji wykorzystano mikroelektrody. W przypadku tych głębokich tkanek zapewnia to lepszą wydajność i przeżywalność komórek.Wstrzyknęliśmy roztwór plazmidowego DNA do trzeciej komory zarodków myszy. W 11,5 dniu embrionalnym przeprowadziliśmy elektroporację igłową ograniczoną do wzgórza; większość aksonów ze wzgórza projektuje się do kory do szóstego dnia po urodzeniu. Przedstawiamy tutaj mikroelektroporację P-C-A-G-E-Y-F-P do rozwijającej się głowy.Obszar wzgórza został wyznaczony za pomocą RORC, który znakuje wszystkie postmitotyczne neurony wzgórza. Projekcje aksonów w kierunku czwartej warstwy kory, wskazane białymi strzałkami, można również zwizualizować za pomocą EYFP, który wypełnia cały neuron. Położenie czwartej warstwy kory zostało również oznakowane przeciwciałem RORC.Po rozpoczęciu MA technika ta może zostać wykonana w 15 minut na litr, jeśli jest przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o bardzo ostrożnym obchodzeniu się z próbką, aby zapobiec jakimkolwiek uszkodzeniom po wykonaniu tej procedury. W celu zrozumienia molekularnego mechanizmu specyfikacji komórkowej po jej rozwoju można zastosować inne metody, takie jak włączenie specyficznego chromoforu do MDNA.Technika ta otwiera przed badaczami zajmującymi się rozwojem ośrodkowego układu nerwowego możliwość zgłębienia mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za wzorowanie, wzrost aksonów oraz formowanie się obwodów neuronalnych.

mouse-utero-electroporation-controlled-spatiotemporal-gene

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Mysz in Utero Elektroporacja: Kontrolowana w przestrzeni i czasie transfekcja genów

In-utero in-vivo iniekcja i elektroporacja zarodkowego neokortyksu myszy stanowią potężne narzędzie do manipulacji pojedynczymi komórkami progenitorowymi ...

Wewnątrzkomorowe wstrzyknięcie i elektroporacja in utero embrionów myszy w 15. dniu rozwoju (E15)

W niniejszej pracy przedstawiamy dwie techniki manipulowania ekspresją genów w komórkach zwojowych siatkówki (RGCs) myszy za pomocą elektroporacji in utero oraz ex vivo. Techniki te pozwalają badać, w jaki sposób zmiany w ekspresji genów wpływają na rozwój RGCs, prowadzenie aksonów oraz właściwości funkcjonalne.

Elektroporacja in utero oraz ex vivo w celu ekspresji genów w komórkach zwojowych siatkówki myszy

In utero elektroporacja umożliwia szybkie dostarczanie genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo do rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W niniejszej pracy opisujemy wysoce adaptowalny protokół elektroporacji in utero, który może być wykorzystany do dostarczania konstruktów ekspresyjnych do wielu embrionalnych domen OUN, w tym do telencefalonu, diencefalonu i siatkówki.

Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Wewnętrzne ucho myszy jest organem zmysłowym pochodzącym z placody, którego program rozwojowy realizowany jest podczas ciąży. Opisujemy technikę transferu genu in utero, składającą się z trzech etapów: brzusznej laparotomii myszy, mikrowstrzyknięcia do macicy oraz elektroporacji in vivo. Wykorzystujemy cyfrową mikroskopię wideo, aby zademonstrować kluczowe eksperymentalne techniki embriologiczne.

Transfer genów do rozwijającego się ucha wewnętrznego myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Źródło: Lutz, D., et al. Ocena parametrów neuroplastyczności ultrastrukturalnej po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje transdukcję wirusa poprzez wstrzyknięcie do macicy w zarodkach myszy. Ciężarna mysz jest przygotowywana do operacji, a następnie wykonuje się nacięcie w linii środkowej w celu odsłonięcia rogów macicy. Mieszanina wirusa zawierającego pożądany gen i barwnika śledzącego jest wstrzykiwana do zarodków w...

Transdukcja wirusa w macicy u myszy

Pomimo funkcjonalnego i medycznego znaczenia podwzgórza, rzadko próbowano genetycznej manipulacji jego rozwojem in utero. Przedstawiamy szczegółową procedurę elektroporacji in utero do podwzgórza myszy i pokazujemy reprezentatywne wyniki całkowitej i częściowej (regionalnej) transfekcji podwzgórza.

Manipulacja genetyczna myszy rozwijającej podwzgórze poprzez elektroporację in utero

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak specyficznie transfekować różne regiony w ośrodkowym układzie nerwowym C57BL/6 za pomocą elektroporacji in utero. W tym protokole zawarte są szczegółowe instrukcje dotyczące transfekcji regionów, które rozwijają się w korę, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i prążkowie.

Kora mózgowa, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i jądro prążkowia specyficzne dla macicy elektroporacja u myszy C57BL/6

Podwójna elektroporacja w macicy pozwala na celowanie w populacje komórek, które są przestrzennie i czasowo oddzielone. Technika ta jest przydatna do wizualizacji interakcji między tymi populacjami komórek przy użyciu białek fluorescencyjnych w normalnych warunkach, ale także po eksperymentach funkcjonalnych w celu zakłócenia interesujących genów.

Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek

W tym protokole opisujemy, jak wstrzyknąć lentiwirusowi do mysiej jamy owodniowej w E7.5, prowadząc do jednolitej transdukcji całej płytki nerwowej, przy minimalnym szkodliwym wpływie na przeżycie lub rozwój embrionalny.

Celowanie w mysią płytkę nerwową za pomocą nanoiniekcji in utero (NEPTUNE) w 7. dniu embrionalnym

Tutaj opisujemy metodę efektywnego manipulowania krytycznymi ścieżkami rozwojowymi w łożysku myszy in vivo. Odbywa się to poprzez wstrzyknięcie i elektroporację plazmidów CRISPR do łożysk ciężarnych matek w 12,5 dniu embrionalnym.

Mysz In Vivo Ukierunkowana manipulacja CRISPR

Poznaj metodę elektroporacji myszy w macicy do kontrolowanej transfekcji genów w rozwijającym się układzie nerwowym. Technika umożliwia precyzyjne badanie rozwoju mózgu z wykorzystaniem wizualizacji światłowodowej.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Przeglądaj więcej filmów