Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów
15 sierpnia 2011
Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie wydajnej transfekcji genów w rozwijającym się ośrodkowym układzie nerwowym myszy w wybranym punkcie czasowym rozwoju oraz w określonym obszarze mózgu. Osiąga się to najpierw poprzez przygotowanie precyzyjnych kapilar i elektrod igłowych, aby zapobiec uszkodzeniu macicy. Drugim krokiem procedury jest opanowanie unikalnej metody trzymania embrionów przy użyciu światłowodowego kabla oświetlającego, co pozwala na wizualizację małych embrionów w celu ukierunkowanej iniekcji DNA.
Trzecim krokiem procedury jest przeprowadzenie elektroporacji za pomocą elektrod typu pałeczka na powierzchni macicy w celu transfekcji DNA do powierzchownych części mózgu; ostatnim krokiem procedury jest elektroporacja za pomocą elektrod igłowych w głąb struktur mózgu, takich jak wzgórze i podwzgórze. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące specyficzną transfekcję warstw korowych lub wydajną transfekcję we wzgórzu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak standardowa in utero elektroporacja, jest większa widoczność i kontrola nad miejscem elektroporacji embrionów w macicy.
Używamy kabla przypominającego światłowód, który umożliwia wizualizację embrionów z etapu E 9.5 oraz mikroigieł do wprowadzania plazmidowego DNA do głębszych obszarów mózgu, takich jak wzgórze i podwzgórze. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące rozwijającego się mózgu, takie jak różnicowanie neuronów, wzorce budowy mózgu oraz łączność neuronalna. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ precyzyjne ukształtowanie igły, ułożenie elektrody i wspólne pozycjonowanie są wymagające.
Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, aby zobaczyć, jak wykonać precyzyjne elektrody igłowe oraz jak pozycjonować embriony do elektroporacji. Te dwa kroki są kluczowe dla uzyskania pomyślnych rezultatów. Do przygotowania kapilar należy użyć wyciągacza mikropipet zgodnie z instrukcją producenta.
W tej procedurze stosujemy szklane kapilary o średnicy jednego milimetra bez wewnętrznego włókna. Wyciągnięte igły powinny mieć długość od 800 µm do 1 mm od końcówki, przy średnicy zewnętrznej mniejszej niż 60 µm; za pomocą mikroskopu sekcyjnego i pęsety przycina się końcówki igieł do średnicy od 20 do 30 µm. Każdą igłę należy zmierzyć za pomocą mikrometru.
Następnie przygotuj mikroelektrody poprzez nawijanie. Jeden koniec drutu wolframowego owiń wokół pozłacanego pinu. Do elektrod ujemnych użyj drutu wolframowego, a do elektrod dodatnich drutu platynowego.
Przymocuj drut do pinu za pomocą param. Następnie włóż drut do plastikowej rurki patyczka higienicznego i równomiernie owiń oba końce folią phim. Starannie oszlifuj końcówkę drutu drobnym papierem ściernym, aż osiągnie ona średnicę od 20 do 30 µm na samym wierzchołku oraz 60 µm w odległości od 800 µm do 1 mm od końcówki. Ponownie sprawdź końcowe wymiary za pomocą mikrometru.
Następnie zanurz zaostrzony drut w kropli lakieru do paznokci, aby nałożyć cienką warstwę izolacyjną na cały drut. Po wyschnięciu lakieru użyj patyczka higienicznego nasączonego acetonem, aby usunąć go z ostatnich 200 micrometers końcówki drutu. Elektrody platynowe są kupowane jako gotowe produkty i nie wymagają przygotowania.
W tej procedurze używamy elektrod CUY six 10 P four dash one nepo gene. Oczyszczamy plazmowy DNA metodą maxi prep lub równoważną, przenosimy 100 µg DNA do nowej probówki i dodajemy 10 µL 1% barwnika fast green. Używamy buforu TE, aby zwiększyć objętość do 100 µL, osiągając końcowe stężenie plazmowego DNA wynoszące 1 µg/µL. Roztwór delikatnie mieszamy pipetując, a następnie wirujemy roztwór DNA przez pięć minut przy 14 000 RPM w temperaturze pokojowej w celu usunięcia zanieczyszczeń i soli.
Przenieś SNAT do nowej probówki. Roztwór DNA może być przechowywany w probówce w temperaturze pokojowej przez cały czas trwania procedury. Następnie podłącz dociągniętą igłę do mikromanipulatora zgodnie z instrukcją producenta i zanurz końcówkę igły w roztworze DNA, aby ją napełnić.
Ostrożnie odstaw mikromanipulator i przygotuj się do zabiegu przed rozpoczęciem operacji. Zważ ciężarną mysz w dniach embrionalnych od 9,5 do 15,5, aby określić masę ciała.
Następnie, drogą dosytroniczną. Wstrzyknij pentobarbital sodu stopnia farmaceutycznego w dawce 50 µg na gram masy ciała i odczekaj pięć minut. Alternatywami dla pentobarbitalu sodu mogą być ketamina, ksylazyna, zewnątrztrachealne środki znieczulające lub anestetyki gazowe.
Po znieczuleniu użyć żyletki i 50% etanolu, aby ogolić sierść z brzucha. Przygotować skórę, stosując naprzemienne przemywanie Betadyną i 70% alkoholem. Wykonać nacięcie w linii środkowej brzucha za pomocą cienkich nożyczek.
Ostrożnie wyciągnij wszystkie rogi macicy na zwilżoną 1x fosforanem soli buforowej (PBS) gazę bawełnianą umieszczoną wokół rany. Przez cały czas utrzymuj macicę w stanie wilgotnym, używając PBS. Wykorzystaj do tego elastyczny kabel światłowodowy.
Umieść kabel pod rogiem macicy. Ustabilizuj macicę pomiędzy światłowodem a kciukiem i delikatnie uciśnij, aby przesunąć embrion bliżej ściany macicy. Gdy embrion zostanie ustawiony głową w lewo i skierowany ku górze, ostrożnie wprowadź szklaną kapilarę do docelowej komory i wstrzyknij około 1 µL roztworu DNA w celu elektroporacji czwartej warstwy kory w 13,5 dniu embrionalnym.
Umieść prętowe elektrody platynowe na zewnątrz macicy i przyłóż pięć impulsów prądu prostokątnego o napięciu 38 V przez 50 ms. W przypadku zastosowania mikroelektroporacji w celu dotarcia do wzgórza lub podwzgórza w 10,5 dniu embrionalnym, wprowadź cienką wolframową elektrodę ujemną do komory, do której wstrzyknięto DNA, a platynową elektrodę dodatnią do macicy. Umieść obszar docelowy pomiędzy końcami obu elektrod i przyłóż sugerowane trzy impulsy prądu prostokątnego o napięciu 7 V przez 100 ms.
Po zakończeniu elektroporacji przywróć róg macicy na jego pierwotne miejsce i dodaj 500 µL PBS. Zaszyj wewnętrzną warstwę nacięcia szwem chirurgicznym. Następnie zamknij warstwę zewnętrzną za pomocą dziewięciomilimetrowego klipsa automatycznego.
Umieść mysz na podgrzewaczce przez dwie godziny, aby umożliwić regenerację po operacji i znieczuleniu. Przedstawiono tutaj electroporację platynową obszaru korowego zastosowaną w dniach embrionalnych 13,5, 14,5 oraz 15,5. Mózgi pobrano w okresie postnatalnym.
Dzień szósty. Warstwa elektroporowanych komórek korowych wyraźnie różni się w każdym eksperymencie. Sugeruje to, że elektroporacja zależna od czasu umożliwia specyficzne dla warstw korowych uzyskanie funkcji (gain of function) oraz utratę funkcji (loss of function).
Jak pokazano tutaj, przeprowadzono elektroporację w głębokich tkankach, takich jak wzgórze i podwzgórze. Stosowanie sztywnych elektrod platynowych często skutkuje niską wydajnością, dlatego do elektroporacji wykorzystano mikroelektrody. W przypadku tych głębokich tkanek zapewnia to lepszą wydajność i przeżywalność komórek.
Wstrzyknęliśmy roztwór plazmidowego DNA do trzeciej komory zarodków myszy. W 11,5 dniu embrionalnym przeprowadziliśmy elektroporację igłową ograniczoną do wzgórza; większość aksonów ze wzgórza projektuje się do kory do szóstego dnia po urodzeniu. Przedstawiamy tutaj mikroelektroporację P-C-A-G-E-Y-F-P do rozwijającej się głowy.
Obszar wzgórza został wyznaczony za pomocą RORC, który znakuje wszystkie postmitotyczne neurony wzgórza. Projekcje aksonów w kierunku czwartej warstwy kory, wskazane białymi strzałkami, można również zwizualizować za pomocą EYFP, który wypełnia cały neuron. Położenie czwartej warstwy kory zostało również oznakowane przeciwciałem RORC.
Po rozpoczęciu MA technika ta może zostać wykonana w 15 minut na litr, jeśli jest przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o bardzo ostrożnym obchodzeniu się z próbką, aby zapobiec jakimkolwiek uszkodzeniom po wykonaniu tej procedury. W celu zrozumienia molekularnego mechanizmu specyfikacji komórkowej po jej rozwoju można zastosować inne metody, takie jak włączenie specyficznego chromoforu do MDNA.
Technika ta otwiera przed badaczami zajmującymi się rozwojem ośrodkowego układu nerwowego możliwość zgłębienia mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za wzorowanie, wzrost aksonów oraz formowanie się obwodów neuronalnych.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej techniki chirurgicznej oraz specjalistycznych elektrod. Podejście to umożliwia precyzyjną transfekcję plazmidowego DNA, co ułatwia prowadzenie badań nad rozwojem mózgu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Techniki transferu genów
- Rozwój embrionalny
Wstęp
- Procedura ma na celu wydajną transfekcję genów w embrionalnym ośrodkowym układzie nerwowym myszy.
- Wykorzystuje precyzyjne kapilary i elektrody igłowe w celu zminimalizowania uszkodzeń macicy.
- Obejmuje unikalną metodę unieruchamiania embrionów z wykorzystaniem wizualizacji światłowodowej.
- Przeprowadzana jest elektroporacja w celu transfekcji DNA do docelowych obszarów mózgu.
Cel badania
- W celu przeprowadzenia ukierunkowanej transfekcji genów na konkretnych etapach rozwoju.
- W celu zwiększenia widoczności i kontroli podczas procesu iniekcji.
- W celu zbadania kluczowych kwestii dotyczących różnicowania neuronalnego i łączności mózgowej.
Zastosowane metody
- Przygotowanie precyzyjnych kapilar i elektrod do iniekcji DNA.
- Wykorzystanie światłowodów do wizualizacji zarodków.
- Techniki elektroporacji w celu transfekcji DNA do różnych obszarów mózgu.
- Szczegółowe procedury chirurgiczne dotyczące manipulacji zarodkami i dostarczania DNA.
Główne wyniki
- Odnotowano pomyślną transfekcję w warstwach kory oraz głębszych strukturach mózgu.
- Wykazano większą kontrolę nad miejscem transfekcji w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia procesów rozwoju mózgu.
Wnioski
- Metoda ta stanowi niezawodne podejście do transfekcji genów u embrionów myszy.
- Zapewnia ona istotne korzyści w zakresie widoczności i precyzji w badaniach z zakresu neuronauki.
- W przyszłych badaniach można wykorzystać tę technikę do zgłębiania różnych aspektów rozwoju mózgu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Elektroporacja in utero umożliwia wczesną analizę funkcjonalną genów kandydackich w rozwijającym się mózgu, co wspomaga walidację celów przed generowaniem modeli transgenicznych. Podejście to zmniejsza zależność od linii CRE, zwiększa dostęp do takich obszarów jak wzgórze i podwzgórze oraz przyspiesza ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania celów neurorozwojowych. Dzięki zapewnieniu przestrzennie i czasowo kontrolowanej transfekcji, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną podczas wczesnego testowania hipotez dotyczących celów.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia testowanie funkcjonalne genów sygnałowych i genów kierowania aksonami w konkretnych embrionalnych obszarach mózgu w celu wyjaśnienia hipotez terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Stanowi szybką i kostoeffektywną alternatywę dla modeli knock-in/knock-out zależnych od CRE w ramach wstępnej analizy celów terapeutycznych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera badania nad wzmocnieniem i utratą funkcji (gain- and loss-of-function) w obszarach pozbawionych specyficznych dla regionu linii CRE, co zwiększa pewność co do wybranego celu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowo ocenialne wzory transfekcji w warstwach kory i głębokich strukturach mózgu do przesiewania opartego na fenotypie.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje zestandaryzowane przygotowanie elektrod i dostarczanie DNA w celu poprawy powtarzalności między eksperymentami.
- Skalowalność: Umożliwia wielokrotne wykorzystanie wizualizacji światłowodowej i dostępu do macicy za pomocą kapilar w celu zapewnienia spójnej manipulacji embrionami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Ułatwia badanie różnicowania neuronów, wzorca budowy mózgu oraz połączeń neuronalnych od wczesnej embriogenezy po analizy postnatalne.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia badanie funkcji genów w głębokich strukturach mózgu, takich jak wzgórze i podwzgórze, co jest istotne w modelach zaburzeń neurorozwojowych.
- Pewność prognostyczna: Zależna od czasu elektroporacja umożliwia transfekcję specyficzną dla poszczególnych warstw, wspierając modelowanie odpowiedzi w zależności od dawki i czasu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, umożliwiając ukierunkowaną na hipotezy modulację genów w regionach embrionalnego mózgu, co wspiera identyfikację związków wiodących oraz wybór modeli przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez ukierunkowaną transfekcję genów kandydackich w strefach komorowych i głębokich strukturach mózgu.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, rozdzielczych przestrzennie wyników transfekcji, które wspierają porównawczą analizę warunków w badaniach fenotypowych.
- Analityka: Umożliwia pomiar wydajności transfekcji oraz specyficzności względem warstw kory za pomocą reporterów fluorescencyjnych i immunobarwienia.
- Badania translacyjne: Łączy funkcje genów we wczesnym okresie embrionalnym z postnatalną organizacją mózgu i efektami w zakresie łączności neuronalnej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy zstandaryzowaną, wielokrotnego użytku platformę do transfekcji embrionalnego mózgu dla wielu genów docelowych i punktów czasowych rozwoju.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w wczesnej walidacji celów neurorozwojowych poprzez precyzyjną spatiotemporalną modulację genów.
- Wartość operacyjna: Zwiększa powtarzalność dzięki standaryzacji przygotowania kapilar i elektrod, wizualizacji światłowodowej oraz kontrolowanym parametrom elektroporacji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, umożliwiając wczesną ocenę funkcjonalną celów, co ogranicza inwestycje w słabo zwalidowane kandydatury.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez generowanie danych funkcjonalnych w embrionalnych układach istotnych dla danej choroby przed kosztownym tworzeniem modeli.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrochirurgii, pracy z embrionami oraz wytwarzania elektrod z drutów wolframowych/platynowych przy użyciu wyciągaczy kapilarnych.
- Zależy od specjalistycznego instrumentarium, w tym światłowodowych kabli świetlnych, mikromanipulatorów oraz elektroporatorów umożliwiających precyzyjną kontrolę napięcia i impulsu.
- Wymaga standaryzacji pozycjonowania embrionów, stężenia DNA oraz parametrów elektroporacji pomiędzy użytkownikami i laboratoriami w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody do różnych stadiów embrionalnych (E9.5–E15.5) i celów w mózgu (struktury korowe w przeciwieństwie do struktur głębokich, takich jak wzgórze/podwzgórze).
- Ograniczenia praktyczne obejmują trudności techniczne w formowaniu elektrod igłowych oraz utrzymanie integralności macicy podczas procedur, co zaznaczono w protokole.
