Test ilościowy infekcji bakteryjnych: metoda ilościowego określania wewnątrzgałkowego obciążenia bakteryjnego w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej

Bakteryjne zapalenie wnętrza gałki ocznej to zapalna dolegliwość oczu, która występuje, gdy Bacillus cereus - bakteria chorobodawcza - infekuje okolicę wewnątrzgałkową.

Aby określić ilościowo infekcję bakteryjną, umieść uśpiony mysi model bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej z boku na stole operacyjnym. Zastosuj lekki ucisk pod okiem, aby pomóc odłączyć gałkę oczną od oczodołu. Przenieść gałkę oczną do probówki zawierającej odpowiedni bufor uzupełniony koktajlem inhibitorów proteazy.

Homogenizuj tkankę oka, aby ją rozpaść, uwalniając bakterie w zawiesinie. Inhibitory proteazy obecne w buforze dezaktywują uwolnione proteazy komórkowe, aby utrzymać żywotność bakterii. Następnie należy seryjnie rozcieńczyć zawiesinę bakteryjną, aby uzyskać różne stężenia Bacillus cereus.

Wziąć ustawioną pod kątem płytkę hodowlaną zawierającą wzbogacone podłoże agarowe i rozdzielić rzędy odpowiadające każdemu stężeniu rozcieńczenia. Dozuj kilka kropli z zawiesiny bakteryjnej na wierzch wyznaczonego rzędu i pozwól jej spłynąć, aż dotrze do końca płytki, pomagając w równomiernym rozprzestrzenianiu się bakterii. Spłaszcz płytkę i inkubuj.

Podczas inkubacji każda bakteria wykorzystuje składniki odżywcze z agaru do namnażania się i tworzenia indywidualnych kolonii. Liczba kolonii zmniejsza się, co odpowiada wzrostowi rozcieńczenia zawiesiny bakteryjnej. Policz liczbę kolonii w danym rzędzie, aby określić ilościowo obciążenie bakteryjne oka.

W odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym dodać 400 mikrolitrów PBS uzupełnionego inhibitorem proteazy w jednej znakowanej autoklawowanej probówce do zbioru na oko na lodzie i umieścić otwarte, cienkie kleszcze po obu stronach zakażonego oka. Dociśnij końcówki w dół w kierunku głowy, aby podeprzeć oko.

Gdy szczypce znajdą się za kulą oka, ściśnij szczypce razem i odciągnij kleszcze od głowy, aby odłączyć gałkę oczną. Następnie natychmiast umieść gałkę oczną w odpowiednio oznakowanej probówce do poboru. W ciągu 60 minut od pobrania próbki umieść zamknięte probówki do pobierania w homogenizatorze tkankowym i homogenizuj próbki przez dwa jednominutowe okresy homogenizacji, z 30-sekundowym okresem odpoczynku pomiędzy nimi.

Po homogenizacji umieścić próbki na lodzie i użyć 20-mikrolitrowych podwielokrotności homogenatu do seryjnego rozcieńczania próbek w 180 mikrolitrach PBS na rozcieńczenie, aż do osiągnięcia współczynnika 1 razy 10 do ujemnego 8. Następnie oznaczyć każdy rząd kwadratowej, wstępnie podgrzanej płytki BHI odpowiednim stężeniem rozcieńczenia i przy płytce nachylonej pod kątem 45 stopni, dodać 10 mikrolitrów każdego rozcieńczenia do oddzielnych rzędów na górze płytki. Pozwól każdej próbce biegać, aż prawie dotrze do dna płytki, zanim położysz płytkę płasko. Gdy próbki zostaną wchłonięte przez agar, przenieś płytkę do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Kolonie powinny zacząć być widoczne po ośmiu godzinach inkubacji.

Aby uzyskać dokładne odwzorowanie stężenia w próbce, policz wiersz, w którym znajduje się od 10 do 100 kolonii.