Edycja genomu oparta na nukleazie palca cynkowego: technika modyfikacji genomu w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych za pomocą dwuniciowego mechanizmu naprawy zależnego od homologii

Nukleaza palca cynkowego lub ZFN zawiera stabilizowaną jonami makrodomenę wiążącą DNA, połączoną z domeną endonukleazy za pomocą łącznika. Struktura ta pomaga zachować specyficzność podczas cięcia DNA.

Aby użyć ZFN do edycji genomu, należy wziąć hodowlę ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Uzupełnij go o plazmid kodujący ZFN. Dodaj plazmid naprawczy zawierający gen docelowy i gen oporności na antybiotyki umieszczony między ramionami homologicznymi lub HA. Elektroporuj mieszaninę komórka-DNA, w której prąd elektryczny ułatwia wejście plazmidów do wnętrza komórki.

Po wejściu do środka motywy palców cynkowych translowanego ZFN wiążą się z trojaczkami komplementarnych par zasad w genomie gospodarza, prawidłowo pozycjonując endonukleazę restrykcyjną Fok-1 w miejscu docelowym. ZFN wiążą się z przeciwległymi niciami w parach, umożliwiając homodimeryzacji Fok-1 utworzenie aktywnego centrum katalitycznego, w którym Fok-1 generuje dwuniciowe pęknięcia DNA lub DSB, wytwarzając zwis czteronukleotydowy.

Obecność HA w plazmidzie naprawczym kieruje naprawą zależną od homologii, w której zwisający koniec odwraca się i wykorzystuje homologiczną sekwencję HA jako matrycę. Synteza DNA j