Edycja genomu oparta na nukleazie palca cynkowego: technika modyfikacji genomu w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych za pomocą dwuniciowego mechanizmu naprawy zależnego od homologii

Nukleaza palca cynkowego lub ZFN zawiera stabilizowaną jonami makrodomenę wiążącą DNA, połączoną z domeną endonukleazy za pomocą łącznika. Struktura ta pomaga zachować specyficzność podczas cięcia DNA.

Aby użyć ZFN do edycji genomu, należy wziąć hodowlę ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Uzupełnij go o plazmid kodujący ZFN. Dodaj plazmid naprawczy zawierający gen docelowy i gen oporności na antybiotyki umieszczony między ramionami homologicznymi lub HA. Elektroporuj mieszaninę komórka-DNA, w której prąd elektryczny ułatwia wejście plazmidów do wnętrza komórki.

Po wejściu do środka motywy palców cynkowych translowanego ZFN wiążą się z trojaczkami komplementarnych par zasad w genomie gospodarza, prawidłowo pozycjonując endonukleazę restrykcyjną Fok-1 w miejscu docelowym. ZFN wiążą się z przeciwległymi niciami w parach, umożliwiając homodimeryzacji Fok-1 utworzenie aktywnego centrum katalitycznego, w którym Fok-1 generuje dwuniciowe pęknięcia DNA lub DSB, wytwarzając zwis czteronukleotydowy.

Obecność HA w plazmidzie naprawczym kieruje naprawą zależną od homologii, w której zwisający koniec odwraca się i wykorzystuje homologiczną sekwencję HA jako matrycę. Synteza DNA jest kontynuowana poprzez dodawanie nukleotydów komplementarnych do genu docelowego.

Powstałe luki są ligowane, co ułatwia wprowadzenie genu. Dodatkowo, gen oporności na antybiotyki bez promotora ulega ekspresji z promotora gospodarza przed miejscem insercji. Pomyślnie edytowane komórki rosną w pożywce selekcyjnej antybiotyków.

Zacznij od hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w pożywce hESC na 6-dołkowej płytce zawierającej mitomycynę C-inaktywowany mysi zarodkowy fibroblast (MEF), komórki żywiące się na żelatynie. Każdego kolejnego dnia po posiewie, aż hPSC osiągnie 50% zbieżności, należy użyć szklanej pipety i odkurzyć, aby usunąć całą objętość pożywki. Zastąp 3 mililitrami ciepłej pożywki hESC na studzienkę.

Na dzień przed celowaniem należy usunąć pożywkę hESC i dodać świeżą, wstępnie podgrzaną pożywkę hESC uzupełnioną 10 mikromolowymi Y27632. Przygotuj również jedną lub dwie 6-dołkowe płytki z lekoopornymi komórkami zasilającymi MEF od myszy DR4. W dniu celowania przygotuj roztwory do transfekcji, pipetując 5 mikrogramów plazmidu 1 i 2 o ekspresji nukleazy palca cynkowego do 1,5-mililitrowej probówki.

Dodaj 30 mikrogramów plazmidu dawcy naprawy, a następnie wystarczającą ilość 1X soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, aby zwiększyć objętość do 300 mikrolitrów. Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby zapewnić 50% zbieżność. Następnie za pomocą szklanej pipety i odkurzacza usuń pożywkę z płytki hPSC. Następnie umyj komórki 2 mililitrami ciepłego 1X PBS. Po zassaniu PBS dodaj 0,5 mililitra 0,25% roztworu trypsyny EDTA, bezpośrednio na komórki.

Umieścić w inkubatorze do hodowli tkankowych na około 10 minut lub do momentu, gdy warstwa podajnika zacznie odrywać się od płytki. Po inkubacji dodaj 2 mililitry ciepłej pożywki esWash do każdej studzienki, aby zatrzymać reakcję trypsyny. Zbierz komórki z każdej studzienki, upewniając się, że komórki podajnika odpadają jako arkusz. Zawartość każdej studzienki należy odpipetować do pojedynczej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów, łącząc wszystkie studzienki, i rozetrzeć komórki za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej.

Dodaj pożywkę esWash, aby doprowadzić zawiesinę komórek do 40 mililitrów. Odczekaj jedną do dwóch minut, aby duże kawałki podajnika osiadły na dnie probówki, a następnie usuń supernatant za pomocą pipety serologicznej i umieść w świeżej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Po odwirowaniu zawiesiny komórek przez pięć minut w temperaturze 190 x g, odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Ponownie zawiesić ogniwa w 500 mikrolitrach 1X PBS.

Połączyć zawieszone komórki z przygotowanym wcześniej roztworem do transfekcji osocza. Odpipetować komórki i mieszaninę transfekcji do 4-milimetrowej kuwety do elektroporacji i umieścić na lodzie na trzy do pięciu minut. Ustaw parametry programu wykładniczego w systemie elektroporacji na 250 woltów, 500 mikrofaradów, nieskończoną rezystancję i 4-milimetrowy rozmiar kuwety. Elektroporuj ogniwa, a następnie umieść kuwetę z powrotem na lodzie na trzy minuty.

Ponownie zawiesić elektroporowane ogniwa w 18 mililitrach ciepłych pożywek hESC uzupełnionych 10 mikromolowymi Y27632. Sprawdź DR4 MEF pod mikroskopem. Umieścić 3 mililitry zawiesiny jednokomórkowej w każdym dołku 6-dołkowej płytki zawierającej komórki zasilające DR4 i wrócić do inkubatora. Trzeciego dnia po posiewie zastąp pożywkę na komórkach pożywką hESC bez Y27632. W 4. dniu należy zastąpić niesuplementowane pożywki pożywką zawierającą odpowiedni antybiotyk selekcyjny. Stosuje się tutaj Puromycynę.