JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 2:15 min • July 8th, 2025
Nanoostrza to syntetyczne cząsteczki wirusopodobne bez zamkniętego w kapsułkach wirusowego materiału genetycznego, co czyni je odpowiednimi nośnikami dla obcych ładunków do komórek gospodarza. Te nanoostrza są zbudowane przy użyciu retrowirusowego rdzenia wirusa białaczki myszy otoczonego dwuwarstwową błoną lipidową pochodzącą z eukariotycznych komórek produkcyjnych używanych do składania nanoostrzy in vitro.
Rdzeń zawiera enzym Cas9 skompleksowany z sgRNA specyficznym dla docelowej sekwencji genomu. Białka rdzeniowe są otoczone białkami otoczkowymi, które zawierają domenę transbłonową lub TM, która przechodzi przez dwuwarstwę lipidową. TM przyłącza się do zewnątrzkomórkowej glikoproteinowej domeny powierzchniowej lub SU, która wystaje z dwuwarstwowej powłoki.
Aby użyć nanoostrzy do edycji genów, należy pobrać kulturę przylegających komórek docelowych i uzupełnić ją roztworem nanoostrzy. W hodowli wystający SU nanoostrza rozpoznaje odpowiedni receptor na powierzchni komórki gospodarza i wiąże się z nim. Prowadzi to do modyfikacji w strukturze domeny SU, ułatwiając jej wydanie.
Zmiany te wywołują zmiany konformacyjne w domenie TM, która następnie wiąże się z błoną gospodarza. To wiązanie zbliża nanoostrze do komórki gospodarza, umożliwiając fuzję dwuwarstwowej błony wirusa z błoną gospodarza, a rdzeń wirusa przemieszcza się do cytoplazmy.
Po wejściu do komórki rdzeń rozpada się, uwalniając kompleks Cas9-sgRNA, który może przeprowadzać edycję genomu w miejscu docelowym.
W celu transdukcji komórek docelowych za pomocą nanoostrzy należy zastąpić pożywkę do hodowli komórkowej 500 mikrolitrami pożywki zawierającej oczyszczone nanoostrza. Po czterech do sześciu godzinach inkubacji komórek wymień pożywkę na normalną ilość świeżej pożywki.